Einfache mikrofluidischen Systemen für

Hallo, ich bin Shamal, ein Postdoktorand bei TUR Kika am Nationalen Zentrum für Biologische Wissenschaften Indien. In diesem Video zeige ich Ihnen, wie man ein Bio-Mikrogerät unter Verwendung von Soft-Lithographie-Techniken in einer regulären Laborumgebung herstellt. Ich werde diese Geräte für hochauflösende zelluläre und subzelluläre Bildgebung genetischer Modellorganismen verwenden.

Das vorliegende Protokoll ermöglicht es Forschern, diese Zeitrafferaufnahmen an betäubungsfreien, intakten Organismen durchzuführen. Beginnen wir also. Wir haben eine einfache mikrophonische Vorrichtung entwickelt, um die in vivo-Bildgebung genetischer Modellorganismen wie C. elegans, intakte Oph und Zebrafisch im Labor ohne Anästhesie durchzuführen.

In dieser Studie stellen wir ein auf einer Membran basierendes Clearing-Mobilisierungsgerät vor, das mittels weichen Abformens von PDMS hergestellt wird. Um einen einzelnen Organismus zu fixieren, positionieren wir ein einzelnes Tier unter einem Stereomikroskop und entnehmen das Tier mithilfe eines kleinen Tropfens Pufferlösung mit einer Mikropipette, führen das einzelne Tier in den Durchflusskanal ein und fixieren es unter der PTMS-Membran. Dabei wird eine druckbeaufschlagte Stickstoffgasverbindung über ein Drei-Wege-Kugelventil verwendet.

Entwerfen Sie die mikrofredischen Strukturen mithilfe einer Reinigungssoftware. Reinigen Sie zwei mal zwei Zentimeter große Siliziumwafer eine Minute lang in 20 % KH und spülen Sie sie mit destilliertem Wasser ab. Trocknen Sie die Stücke mit Stickstoffgas ab und trocknen Sie sie vier Stunden lang bei 122 °C aus.

Spinco-Hexametall auf Siliziumplättchen bei 500 U/min für fünf Sekunden und bei 3000 U/min für 30 Sekunden. Spinco-SU 8 2 0 2 5 auf Siliziumwafern bei 500 U/min für fünf Sekunden und bei 2000 U/min für 30 Sekunden. Die beschichteten Siliziumplättchen bei 65 Grad Celsius eine Minute und anschließend bei 95 Grad Celsius zehn Minuten lang vorbacken.

Belichten Sie die gebackenen, mit SU-8 beschichteten Wafer mit einer 200-Watt-UV-Lampe durch die Fotomaske für Design eins und Design zwei jeweils für die Flüssigkeitsschicht und die Steuerschicht. Danach die Wafer nachvernetzen bei 65 Grad Celsius für eine Minute und bei 95 Grad Celsius für 10 Minuten. Entwickeln Sie die Strukturen mit der SU-8-Entwicklerlösung für 20 Minuten.

Kodieren Sie die Proben mit Trichlorperfluorcetselindampf in einem Exsikkator für zwei Stunden. Mischen Sie die Polydylxox-Basis und den Härter im Verhältnis 10 zu 1 nach Gewicht. Entgasen Sie die Mischung, um alle Luftblasen, die während des Mischens entstanden sind, zu entfernen.

Geben Sie eine fünf Millimeter dicke PDMS-Mischung auf Siliziumwafer mit SC-Gewichtsmuster des Designs. Zwei vorsichtig, um die Bildung von Luftblasen zu vermeiden. Spin-Beschichten und gleichmäßige Schicht aus PDMS auf Siliziumwafer mit Design eins für die Flussschicht bei 500 U/min für fünf Sekunden und tausend 500 U/min für 30 Sekunden.

Beide Teile des Designs eins und des Designs zwei, die PDMS enthalten, bei 50 Grad Celsius sechs Stunden lang backen. Den PDMS-Teil mithilfe einer Sub-Klinge mit SCH-Muster zwei aus dem Silizium-Substrat ausschneiden. In der PDMS-Form oberhalb des Reservoirs, das mit der Hauptfalle verbunden ist, ein kleines Loch stanzen.

Unter Verwendung einer Punktionsnadel mit der größten Stärke oder einer 18-Gauge-Nadel. Den unteren Bereich der Steuerschicht und den oberen Bereich der Flussschicht zwei Minuten lang 18-Watt-Luftplasma aussetzen. Die beiden plasmabehandelten Oberflächen vorsichtig unter leichtem Druck zusammenfügen und zwei Stunden lang bei 50 Grad Celsius aushärten.

Schneiden Sie die verbundenen Vorrichtungen mit dem SUH-Design eins vom Silizium-Substrat ab und stanzen Sie Zugangsöffnungen an den Einlass- und Auslassreservoiren des Strömungskanals aus. Exponieren Sie das untere PD der Vorrichtung und eine saubere Glasabdeckung. Legen Sie sie für zwei Minuten einer 18-Volt-Luft-Plasma-Behandlung aus.

Platzieren Sie die beiden plasmabehandelten Oberflächen mit leichtem Druck aufeinander und backen Sie sie zwei Stunden lang bei 50 Grad Oberfläche. Bewahren Sie das Gerät zur späteren Verwendung in einer sauberen Umgebung auf. Nach der Herstellung der Geräte zeige ich Ihnen, wie Sie mit einer PDMS-Membran c. elegans im Gerät immobilisieren können. Verbinden Sie ein Ende eines Microflex-Schlauchs mit einem unter Druck stehenden Stickstoffgasversorgungsregler und das andere Ende über eine 18-Gauge-Nadel mit dem Hauptfallenreservoir.

Ein dreiwegiger Hahn, der in der Mitte der Schlauchverbindung verwendet wird, ermöglicht das Anlegen oder Ablassen des Drucks auf die Membran. Füllen Sie den Schlauch und die Verbindung zum PDMS-Gerät mit einer 10 cm hohen Säule destillierten Wassers, bevor Sie ihn mit dem Reservoir der Hauptfalle verbinden. Drehen Sie das Ventil der Stickstoffversorgung auf Protein-PSI und beobachten Sie die Auslenkung der Membran der Hauptfalle in Richtung des Durchflusskanals bei geringer Vergrößerung eines invertierten Mikroskops.

Öffnen Sie also das Dreiventil vollständig und bringen Sie die Membran in die Ruheposition. Füllen Sie den Durchflusskanal 10 Minuten lang mit Puffer. Suchen Sie vor einem Experiment mithilfe eines Mikroskops mit einfacher Vergrößerung ein einzelnes See-Akrobatik-Exemplar.

Wählen Sie ein einzelnes Tier mit einem kleinen Pufferlösungsvolumen in eine Mikrospitze auf. Führen Sie das einzelne Tier durch den Einlass des Flusskanals. Stellen Sie den Pipettierdruck so ein, dass sich das einzelne Tier unter der Hauptfalle befindet.

Erhöhen Sie den Druck der PDMS-Membran langsam, um das Tier an der Kanalgrenze zu positionieren und es mit einem Druck von sieben bis 14 PSI zu fixieren. Verwenden Sie ein umgekehrtes Mikroskop mit der gewünschten Einstellung für hochauflösende Auflicht- oder Fluoreszenzbildgebung. Nehmen Sie einzelne oder zeitgesteuerte Fluoreszenzbilder mit einer vordefinierten Bildfrequenz auf.

Lösen Sie den Fangdruck und beobachten Sie das Fortbewegungsverhalten des Tieres. Spülen Sie das Tier fünf Minuten lang bei geringer Vergrößerung und bringen Sie ein frisches Tier ein. Um die DevOp-Schritte zu wiederholen, verwenden Sie die abgeschnittene Mikropipettenspitze, um eine einzelne Oph-Larve aufzunehmen und sie in die mikroferrische Vorrichtung größerer Größe einzuführen.

Schieben Sie die einzelne Larve durch den Einlass des Durchflusskanals. Erhöhen Sie den Druck der PDMS-Membran langsam und fixieren Sie sie mit sieben ESI-Druck. Verwenden Sie ein umgekehrtes Mikroskop für die Fluoreszenzabbildung bei niedriger Vergrößerung und nehmen Sie zeitaufgelöste Fluoreszenzbilder für die Transportabbildung auf.

Lösen Sie den Fallen-Druck und beobachten Sie das Bewegungsverhalten der Larve bei niedriger Vergrößerung. Nutzen Sie das gleiche Geräteprinzip, um 30 Stunden nach der Befruchtung beispiellose Fische zu fixieren und Zeitrafferaufnahmen aufzunehmen. Val-Herz.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie in der Lage sein, ähnliche Mikrogeräte in Ihrem eigenen Labor herzustellen und sie erfolgreich zur Immobilisierung von Organismen für hochauflösende, beeindruckende Experimente zu nutzen. Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren Experimenten.