Messung der Faktor V-Aktivität in humanem Plasma unter Verwendung eines Mikroplatten Koagulationsanalyse

Das übergeordnete Ziel des folgenden Verfahrens bestand darin, einen Mikroplatten-Assay zu entwickeln, der die Aktivität des Gerinnungsfaktors V während der Bildung eines Fibrin-Gerinnsels in menschlichem Plasma misst. Als Reaktion auf eine Verletzung wird der Blutgerinnungsprozess aktiviert und führt zu einer Reihe von Umwandlungsreaktionen von Zymogenen in Proteasen, die letztendlich zur Bildung des Gerinnungsenzyms Thrombin führen. Thrombin spaltet lösliches Fibrinogen in Fibrinmonomere, die sich anschließend zu einem unlöslichen Fibringerinnsel verbinden. Normalerweise verbleibt das Blut im gesunden oder unverletzten Zustand als frei flüssige Flüssigkeit, und die Menge an gebildetem Fibrin entspricht der Menge an abgebautem oder zersetztem Fibrin.

Doch bei bestimmten Krankheitszuständen führt eine übermäßige Gerinnung zu Herzerkrankungen und Schlaganfällen, während eine zu geringe Gerinnung zu Blutungsneigungen führt, wie sie häufig bei den Hämophilien beobachtet werden. Faktor V ist ein Protein im Plasma, das in seiner aktivierten Form Faktor V a ein entscheidender Beschleuniger der Thrombinbildung während der Fibringerinnselbildung im Rahmen des Prothrombin-Enzymkomplexes ist; Prothrombin setzt sich aus vier Komponenten zusammen: Faktor X a, dem Protease-Faktor V a, dem Cofaktor-Lipid, der Oberfläche und Calcium. Faktor V a erhöht die katalytische Effizienz bzw. kcat von Faktor X a gegenüber seinem Substrat Prothrombin um etwa das 3.000-Fache und verstärkt dadurch die Thrombinbildung und die Fibringerinnselbildung erheblich.

Die Mikroplattenplattform wird zur Messung enzymatisch katalysierter Vorgänge bevorzugt, da sie bequem, zeitsparend, mit geringen Probenmengen arbeitet, eine kontinuierliche Überwachung ermöglicht und eine hohe Durchsatzleistung bietet. Das Ereignis der Fibrin-Gerinnung kann mit einem Mikroplattenreader überwacht werden, indem der Anstieg der Lichtabsorption von Plasma gemessen wird, während es sich von einem klaren, gelben Zustand ohne Fibringerinnsel und mit minimaler Lichtabsorption zu einem undurchsichtigen, trüben Zustand mit Fibringerinnsel und maximaler Lichtabsorption verändert. Die Hauptvorteile dieser Methode gegenüber bestehenden Verfahren wie manuellen Neigrohrtests oder Tests mit automatisierten Analysegeräten liegen darin, dass sie schnell, kostengünstig, mit geringem Probenbedarf arbeitet und eine hohe Durchsatzleistung aufweist.

Der Test misst die Aktivität des unbeabsichtigt aktivierten und des durch Thrombin aktivierten Faktor Fünf, um eine vollständige quantitative Beurteilung seiner gesamten funktionellen Aktivität zu erhalten. Diese Technik wird Derek Tilley, ein Masterstudent im Labor, demonstrieren. Um die Faktor-Fünf-Aktivität in einer Plasma probe zu bestimmen, ist es notwendig, eine Standardkurve für die einstufige Faktor-Fünf-Aktivität aufzustellen, basierend auf der Zeit der Fibrin-Gerinnung in Panel A und der Anfangsgeschwindigkeit der Fibrin-Gerinnung in Panel B, wobei normales humanes Plasma (NHP) als Standard verwendet wird, das per Definition eine Einheit Faktor-Fünf-Aktivität pro ml enthält. Taue das Faktor-Fünf-defiziente Plasma, das normale humane Plasma und die Probenplasmen unbekannter Konzentration sowie Thromboplastin bei 37 Grad Celsius 10 Minuten lang auf.

Mischen Sie das Faktor-V-mangels Plasma und Thromboplastin vorsichtig und überführen Sie es in separate Kunststoffwaschschalen. Inkubieren Sie es auf Eis. Lagern Sie das normale humanes Plasma und die Plasmaproben mit unbekanntem Gehalt nach vorsichtigem Mischen ebenfalls auf Eis. Bewahren Sie die Calciumchloridlösung (25 Millimolar) in destilliertem Wasser in einer separaten Waschschale bei Raumtemperatur für die Standardkurven der einstufigen Aktivitätsbestimmung des Faktor V auf.

Bereiten Sie jeweils 200 Mikroliter Verdünnungen der normalen humanen Plasma in zweifacher serieller Verdünnung von 0, 2, 4, 8, 16, 32, 64, 1:28, 2:56 und 512 in HBS pH 7,4 unter Verwendung von 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen vor, wirbeln Sie gründlich um und inkubieren Sie auf Eis. Für die Plasmaproben mit unbekannter Konzentration bereiten Sie jeweils 200 Mikroliter 40-fach verdünntes normales humanes Plasma und unbekannte Probenplasmen in HBS pH 7,4 unter Verwendung von 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen vor. Setzen Sie fünf Mikrotiterstreifen in den Vorlagenhalter des Mikrotiterplattenlesegeräts ein.

Schalten Sie den Mikroplattenreader ein und greifen Sie mit einer Mehrkanalpipette auf die Mikroplattenanwendungssoftware Softmax Pro zu. Geben Sie gleichzeitig mithilfe einer Einzelkanalpipette 50 Mikroliter Faktor-V-defizientes Plasma in alle Proben-Mikroplattenmulden. Fügen Sie mit einer Mehrkanalpipette 50 Mikroliter der hergestellten 10-fachen seriellen Verdünnungen von normalem humanem Plasma sowie der 40-fach verdünnten normalen humanen Plasma- und unbekannten Probenplasmaproben in separate Mikroplattenmulden hinzu. Geben Sie 50 Mikroliter Thromboplastin in alle Probenmulden. Inkubieren Sie im Mikroplattenreader bei 25 Grad Celsius eine Minute lang unter Schütteln während der Sekunden 15 bis 25 der einminütigen Inkubation.

Verwenden Sie den mit dem Mikroplattenreader verbundenen Computer, um auf die Software Softmax Pro Microplate zuzugreifen. Stellen Sie den Mikroplattenreader auf die Absorptionswellenlänge von 405 Nanometern ein, aktivieren Sie den kinetischen Modus bei einer Temperatur von 25 Grad Celsius, und programmieren Sie den Mikroplattenreader so, dass er fünf Sekunden nach der Zugabe von Calciumchlorid schüttelt und anschließend alle fünf Sekunden über einen Zeitraum von sechs Minuten die Absorption bei 405 Nanometern misst. Danach wird das fünfsekündige Schüttelintervall bei der Berechnung der Gerinnungszeiten nicht mehr berücksichtigt. Verwenden Sie zwei Mehrkanalpipetten gleichzeitig, um jeweils 50 Mikroliter Calciumchlorid den beiden Mikroplattenstreifen mit den Proben hinzuzufügen.

Warten Sie 15 Sekunden und drücken Sie unmittelbar danach das Startsymbol in Softmax Pro auf dem Computer, um den Assay zu beginnen. Für jede analysierte Plasma probe wird die Zeit der Gerinnungsbildung bestimmt und als die Zeit in Sekunden definiert, die benötigt wird, um die halb maximale Zunahme der Absorption zu erreichen. Die anfängliche Rate der Gerinnungsbildung wird als die Zunahme der Absorption über die ersten fünf Zeitpunkte des linearen Abschnitts der Absorption gegenüber der Zeit definiert.

Der Umfang der Gerinnungsbildung wird definiert als die Differenz zwischen dem maximalen und minimalen Absorptionswert, der während des Gerinnungsereignisses am Ende des Durchlaufs erreicht wird. Verwenden Sie die Absorptions-Zeit-Profile in Softmax Pro, um Zeitpunkt, Anfangsgeschwindigkeit und Umfang der Gerinnungsbildung für die serielle Verdünnung von normalem humanem Plasma zu bestimmen. Zur Erstellung der Standardkurve für die Faktor-V-Ein-Stufen-Aktivität verwenden Sie die Gerinnungszeiten für das 40-fach verdünnte normale humane Plasma und die unbekannten Probenplasmen, um anhand der Faktor-V-Ein-Stufen-Aktivitäts-Standardkurve die Faktor-V-Aktivität in Einheiten pro Milliliter zu interpolieren.

Dies stellt die Faktor-V-Aktivität in einer Stufe oder die Aktivität ohne beabsichtigte Aktivierung durch Thrombin dar. Dies ist ein repräsentatives Beispiel für die Bildung eines Fibringerinnsels im Faktor-V-Test über die Zeit, erzeugt durch den Mikroplattenreader. Das Profil zeigt die Fibringerinnselbildung unter Verwendung von 32-fach verdünntem normalem menschlichen Plasma in einer einzelnen Mikroplatte.

Nun, die vertikale Achse zeigt die Änderung der Absorption bei 405 Nanometern an, die infolge der Fibrin-Gerinnung auftrat. Die Zeitpunkt der Gerinnselbildung wurde als Mittelpunkt der Absorptions-Zeit-Kurve berechnet, 36,4 Sekunden. Die anfängliche Gerinnungsgeschwindigkeit wurde als 611,88 Milli-Einheiten pro Minute berechnet.

Der Umfang der Trübungsbildung wurde mit 0,35 Einheiten berechnet. Der Faktor-fünf-Assay misst genau die Anfangsrate und den Umfang der Trübungsbildung. Die Überprüfung der Mulden nach Abschluss des Assays bestätigte, dass eine Gerinnungsbildung aufgetreten ist.

Alle Reaktionen erreichten nahezu denselben Grad an CloudFormation, wobei sich die Extinktion bei 405 Nanometern allgemein um zwischen 0,35 und 0,45 Einheiten von der anfänglichen Extinktion vor der Zugabe bis zur maximalen Extinktion nach Thromboplastin und Calciumchlorid veränderte. Beispiele für die Aktivität von Faktor V im Ein-Stufen-Test, die Standardkurve der Gerinnungszeit in Sekunden in Abhängigkeit von der Faktor-V-Aktivität in Einheiten pro Milliliter sowie die Anfangsgeschwindigkeit der Clot-Bildung in Milli-Einheiten pro Minute in Abhängigkeit von der Faktor-V-Aktivität in Einheiten pro Milliliter für normales humanes Plasma sind in Panel A bzw. Panel B dargestellt.

Da Faktor Fünf normalerweise durch Thrombin aktiviert wird, ist der aktive Cofaktor Faktor FünfA. Ein zweiter Test nach Zugabe und Inkubation mit Thrombin ist entscheidend, um die zweistufige Aktivität von Faktor Fünf in einer Plasma probe genau zu messen, wobei eine gezielte Aktivierung durch zugesetztes Thrombin für den zweistufigen Faktor-Fünf-Test erfolgt. Bereiten Sie 200 bis 300 Mikroliter gereinigtes Thrombin in einer Endkonzentration von hundert Nanomolar in HBS pH 7,4 vor und inkubieren Sie es auf Eis. Verdünnen Sie 120 Mikroliter des oben genannten normalen menschlichen Plasmas und der Probenplasmen 40- bis 100-fach mit 170 Mikrolitern HBS pH 7,4, das 2,8 Millimolar enthält.

Calciumchlorid. Geben Sie 10 Mikroliter Thrombin hinzu, um in jeder Probe eine Endkonzentration von 10 Nanomolar zu erreichen. Vortexen Sie gründlich zur Vermischung und inkubieren Sie eine Minute bei 37 Grad. Verdünnen Sie das normale humane Plasma und die Probenplasmen 500-fach, indem Sie 400 Mikroliter HBS pH 7,4 hinzufügen.

Bestimmen Sie die Gerinnungszeit für normales humanes Plasma bei jeder der unbekannten Probenplasmaproben anhand der Absorptions-Zeit-Profile in Soft Max Pro. Unter Berücksichtigung der 500-fachen Verdünnung verwenden Sie die Gerinnungszeit jeder Probe, um die Faktor-V-Zwei-Stufen-Aktivität anhand der Faktor-V-Ein-Stufen-Standardkurve (Gerinnungszeit über Aktivität) zu berechnen. Dies stellt die Faktor-V-Zwei-Stufen-Aktivität dar, also die Aktivität nach gezielter Aktivierung durch Thrombin.

Die Gesamt-Faktor-V-Aktivität kann dann berechnet werden als die Differenz zwischen der zweistufigen Faktor-V-Aktivität und der einstufigen Faktor-V-Aktivität. Die Standardkurve aus dem Logarithmus der Gerinnungszeit versus dem Logarithmus der Faktor-V-Aktivität wurde verwendet, um die Faktor-V-Aktivität in normalem menschlichen Plasma sowie in Plasmen von neun Patienten mit disseminierter intravasaler Gerinnung (DIC) zu bestimmen. Alle neun DIC-Patienten wiesen einstufige Faktor-V-Aktivitäten sowie initiale Gerinnungsgeschwindigkeiten auf, die im Durchschnitt um 54 % bzw. 18 % vermindert waren. Die zweistufige Faktor-V-Aktivität und die Gesamtaktivität waren bei den DIC-Patienten im Vergleich zum normalen menschlichen Plasma im Durchschnitt um 44 % bzw. 42 % vermindert.

Der Faktor fünf und die DIC-Patienten führten zu einer verlängerten Zeit und einer verringerten Rate der Fasergerinnung. Nachdem Sie dieses Video angesehen haben, sollten Sie eine gute Vorstellung davon haben, wie Sie diese Methode in Ihrem Labor umsetzen können. Die Methode kann leicht angepasst werden, um die Aktivität jedes Gerinnungsfaktors im Plasma zu messen, wodurch sie für eine breite Palette von Forschungs- und klinischen Anwendungen geeignet ist.

Letztendlich wird diese Information über Faktor V die Gesundheitsversorgung positiv beeinflussen, indem thrombotische oder blutungsbedingte Erkrankungen wie das disseminierte intravasale Gerinnungssyndrom (DIC) früher diagnostiziert und behandelt werden können.