Lokale und globale Methoden zur Beurteilung der thermischen Nozizeption in

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments besteht darin, die thermische Nozizeption bei Drosophila-Larven zu untersuchen. Dazu werden Drosophila-Larven gewonnen und anschließend optional schädlichen thermischen Reizen ausgesetzt. Die Larven können mit UV-Licht bestrahlt werden, was zu Gewebeschäden und einer sensibilisierten thermischen Nozizeption führt. Anschließend können die Larven entweder lokal mit einer Hitzespitze oder global mittels einer Heizplatte stimuliert werden, um nozizeptive Reaktionen hervorzurufen, die quantitativ gemessen werden können.

Die Hitzeprobe zeigt, dass Larven eine obere Grenze für die nozizeptive Reaktion auf Hitze aufweisen und eine überraschende Beziehung zwischen der Eingangstemperatur und der Amplitude der ausgelösten Reaktion besteht. Der Hitzeteller-Assay zeigt, dass Larven eine stereotypisierte Abfolge nozizeptiver Verhaltensweisen zeigen, die von der Temperatur des umgebenden Wassers und der Aktivität der nozizeptiven Sinnesneuronen abhängt. Die hier beschriebenen Methoden können helfen, zentrale Fragen im Bereich der thermischen Nozizeption zu beantworten, beispielsweise, ob Tiere unterschiedlich auf schädliche thermische Reize reagieren, je nachdem, ob diese lokal oder global präsentiert werden.

Im Allgemeinen haben Personen, die neu im Hitzesonden-Assay sind, Schwierigkeiten, da die Beherrschung des Assays Übung erfordert, um die Variation in Druck, Position und Anwinkelung der verwendeten Sonde zu minimieren. Die visuelle Demonstration des Hitzetisch-Assays ist entscheidend, da die durch steigende Temperaturen hervorgerufenen Verhaltensweisen gesehen werden müssen, um richtig eingeschätzt zu werden. Um eine ausreichende Anzahl an Nachkommen-Larven eines definierten Genotyps von Interesse zu erhalten, züchten Sie den gewünschten Stamm direkt oder setzen Sie Kreuzungen in Flaschen mit Fliegenfutter an, wobei Sie 20 bis 30 jungfräuliche Weibchen und 15 bis 20 Männchen verwenden. Fünf Tage nach der Eiablage ernten und reinigen Sie frühzeitige Larven im dritten Instar, indem Sie das weiche Fliegenfutter ausschöpfen und mit fließendem Wasser durch ein Sieb mit einer Porengröße von 630 Mikron abspülen. Überführen Sie die frühzeitigen Larven im dritten Instar auf ein kleines, feuchtes Futterkissen, um Verhungern und Austrocknung zu verhindern.

Nachdem eine Betäubungskammer hergestellt wurde, mit einer Pinzette oder einem Pinsel vorsichtig 10 Larven im frühen dritten Larvenstadium entlang der Innenseite des Deckels platzieren und schließen. In einem Abzug arbeitend, die Betäubungskammer in ein Verbindungsglas stellen, das einen 10-Milliliter-Becher enthält, in dem ein Wattebausch mit 1,5 Millilitern Diethylether getränkt ist. Den Deckel des Verbindungsglases zuschrauben, um die Larven zwei bis 2,5 Minuten lang den Dampfen von Diethylether auszusetzen.

Nach der Betäubung entfernen Sie die Betäubungskammer aus dem Coplan-Gefäß und lassen sie einige Sekunden im Abzug, damit eventuelle Restdämpfe von Äther abklingen können. Spülen Sie die Larven vorsichtig mit einer Wasser-Sprühflasche aus der Betäubungskammer in eine kleine Petrischale. Trocknen Sie die betäubten Larven leicht ab und befestigen Sie sie dann vorsichtig dorsal nach oben auf einen Streifen doppelseitigen Klebeband, der auf einer drei Zoll mal ein Zoll großen Glasobjektträger befestigt ist.

Platzieren Sie den Objektträger auf der unteren Fläche einer UV-Bestrahlungskammer und bestrahlen Sie die Larven sechs Sekunden lang mit UV-Licht bei einer Intensität von 20 Millijoule pro Quadratzentimeter. Nach der Bestrahlung tauchen Sie den Objektträger in Wasser, um die Larven vorsichtig von dem doppelseitigen Klebeband abzulösen. Mit einer Pinzette oder einem Pinsel die bestrahlten Larven vorsichtig in eine 15 mal 45 Millimeter große Petrischale überführen.

Einemrams-Glaskulturkolben mit einem Milliliter Fliegenfutter, um acht bis 24 Stunden bei 25 Grad Celsius oder der gewünschten Kulturttemperatur zur Wiederherstellung vor der erneuten Beherbergung. Für thermische Nocizeptions-Assays zuerst die Temperatur der thermischen Sonde auf den gewünschten Sollwert einstellen. Mit einem Pinsel oder einer Pinzette eine einzelne Larve vorsichtig auf eine flache Plattform übertragen, wobei sichergestellt werden muss, dass die Larve von einem dünnen Wasserfilm bedeckt ist.

Um die Variation des Drucks zu minimieren und gleichzeitig die korrekte Position sowie den richtigen Winkel der Hitzesonde sicherzustellen, ist Übung der Schlüssel zum Erfolg. Drücken Sie die Sonde vorsichtig gegen die Larve im Segment A4 und üben Sie dabei leichtem Druck mit der Spitze in einem Winkel von etwa 45 Grad zwischen Sonde und Oberfläche der Larve aus. Der Druck sollte eine leichte Delle an der Oberfläche der Larve verursachen und in der Regel ausreichen, um die Fortbewegung zu verhindern.

Setzen Sie die Stimulation der Larven fort, bis eine Rückzugsreaktion auftritt, oder bis der 22. Ausschaltzeitpunkt erreicht ist. Reagierende Larven zeigen typischerweise zunächst ein vorbereitendes Verhalten, bei dem sie Kopf und Schwanz anheben, gefolgt von dem Rückzugsverhalten, bei dem sie sich mindestens 360 Grad rollen. Sobald das Rückzugsverhalten eingeleitet wurde, lösen Sie den Kontakt zum Probierstab und notieren Sie die Latenzzeit oder die zum Rückzug benötigte Zeit.

Wenn innerhalb von 20 Sekunden kein Wegzugsverhalten beobachtet wird, gilt die Larve als Nicht-Responder. Positionieren Sie die Lichtleiter der Glasfaser, um eine ausreichende Beleuchtung mit hohem Kontrast sicherzustellen. Um die Larven zu betrachten, setzen Sie den Heizblock mit der flachen Seite nach oben auf die Heizplatte und stellen Sie anschließend die Heizplatte auf das Mikroskoptisch-Grundgestell.

Schalten Sie die Heizplatte auf die hohe Stufe ein und warten Sie etwa 15 Minuten, bis sich die Temperatur bei 95 Grad Celsius stabilisiert hat. Messen Sie 80 Mikroliter destilliertes Wasser ab und geben Sie den Wassertropfen mit einer Mikropipette in die Mitte einer 60 mal 15 Millimeter großen Petrischale aus Polystyrol. Platzieren Sie mithilfe einer Pinzette vorsichtig eine saubere Larve des mittleren Dritts der dritten Instar in die Mitte des Wassertropfens, wobei möglichst wenig zusätzliches Wasser hinzugefügt werden sollte.

Stellen Sie die Petrischale vorsichtig auf den festen Heizblock des Heizgeräts. Passen Sie die Position der Schale schnell so an, dass die gesamten Larven und der Wassertropfen im Sichtfeld liegen. Starten Sie die Stoppuhr.

Zurzeit wird die Petrischale auf den festen Heizblock der Heizplatte gestellt und der Zeitpunkt des Auftretens jedes Verhaltens wird aufgezeichnet. Fünf. Stereotype Fortbewegungsverhaltensweisen werden beobachtet, nachdem die in Wasser befindliche Larve auf die Heizplatte übertragen wurde. Normales Verhalten in Abwesenheit von Wärme umfasst die Parasol-Fortbewegung, begleitet von suchenden Kopfbewegungen.

Das Verhalten des Kopfschlagens kann danach auftreten, wenn die Larve ihren Kopf schnell in Vorwärts- oder Seitenrichtung bewegt. Diese Bewegung ähnelt ihrer normalen Fortbewegung im Wasser, erfolgt jedoch ruckartiger und geht mit einer anhaltenden seitlichen Rolle einher. Das Verhalten tritt auf, wenn die Larve sich seitlich um mindestens volle 360 Grad dreht.

Dies kann eine variable Anzahl von Malen auftreten und manchmal unvollständige Rollen beinhalten. Für die Bewertung des Verhaltens zählen Sie nur volle 360-Grad-Rollen. Dieses Verhalten ähnelt am meisten der Szene mit lokaler Anwendung der Hitzesonde während des Peitschverhaltens.

Die Larve zeigt schnelle Kontraktions- und Entspannungsbewegungen entlang der anteroposterioren Achse, wodurch der Kopf kurzzeitig der Nähe des Schwanzes kommt. Peitschenbewegungen werden oft in schneller Abfolge beobachtet, manchmal gleichzeitig mit Rollbewegungen. Schließlich zeigt die Larve Anfälle, denen häufig eine Lähmung folgt. Während des Anfalls streckt sich die Larve entlang der anteroposterioren Achse und zeigt eine hochfrequente Ganzkörperbewegung.

Ein Zitterverhalten ohne Biegeparalyse tritt auf, wenn die Larven ihre Bewegung einstellen. Bei einigen Larven ist dies dauerhaft, während andere anschließend eine pulsierende Bewegung mit geringer Frequenz zeigen. In dieser Darstellung des Prozentsatzes der Reagierenden in jeder Kategorie zeigt sich eine Obergrenze der larvalen thermischen Nociceptionsreaktion. Im Hitzesonden-Test reagieren 100 % der Larven schnell, und zwar bis zu einer Sondentemperatur von 52 Grad Celsius.

Jedoch reagieren bei 54 Grad Celsius und höher 90 % oder mehr der Larven selbst nach 20 Sekunden Kontakt nicht. Obwohl diese Larven nach dem 22. Ausschaltvorgang weiterhin Bewegungen ausführen, können die Anzahl der Überschläge oder die Dauer des Aversionszuckverhaltens ebenfalls gemessen und dargestellt werden. Überraschenderweise scheint es eine umgekehrte Beziehung zwischen der Eingangstemperatur des Probes und der Robustheit der Reaktion zu geben, da niedrigere Temperaturen eine höhere Anzahl an Überschlägen hervorzurufen scheinen.

Fünf stereotypische Fortbewegungsverhalten werden beobachtet, wenn die in Wasser eingetauchte Larve auf die Heizplatte übertragen wird. Die durchschnittlichen Latenzzeiten, zu denen diese Verhaltensweisen auftreten, sind hier dargestellt, ebenso wie die durchschnittlichen Wassertropfentemperaturen, die für jede Latenz unter den hier vorgestellten optimalen Testbedingungen gemessen wurden. Der Prozentsatz der Larven, die jeweils eindeutige Verhaltensweisen zeigten, lag zwischen 77 und 100 %. Obwohl gelegentlich die Roll- und Peitschverhalten ausbleiben, überlappen oder in umgekehrter Reihenfolge auftreten, ist hier der Prozentsatz der Larven angegeben, die nach Beginn des Lähmungsverhaltens im Heizplattenversuch überlebt haben. Die Larven wurden bis zur Lähmung erhitzt und anschließend in Standardkulturbedingungen zur Erholung überführt.

Die mit Placebo behandelten Larven erhielten eine vergleichbare Behandlung, ausgenommen der Hitzeeinwirkung, und die Bildung von PPE in lebensfähigen Erwachsenen wurde am siebten bis dreizehnten Tag quantitativ erfasst. Hier treibt MD G vier die Expression von UAS-regulierten Transgenen in allen vier Klassen multi-dendritischer peripherer Sinnesneuronen an. UAS oder one delta C exprimiert eine modifizierte Version des offenen Gleichrichter-Kaliumkanals von Drosophila, der für die synaptische Übertragung erforderlich ist, und UAS orrc one delta NC exprimiert eine weiter modifizierte Version desselben Kanals, die die synaptische Übertragung nicht beeinträchtigt.

Beachten Sie, dass nur Larven, die sowohl den MD-GAL4-Treiber als auch das UAS-ORC1-ΔC-Transgen tragen, bei vier der fünf beobachteten Verhaltensweisen verlängerte Latenzzeiten aufweisen. Nach dem Ansehen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man lokale und globale Reaktionen von GEs-Abfalllarven auf nozizeptive thermische Reize messen kann. Diese Verfahren können mit anderen Methoden wie der genetischen Analyse kombiniert werden, um Gene zu identifizieren, die für die thermische Nozizeption erforderlich sind. Bei der Durchführung des Wärmeprobe-Tests ist es wichtig, die Variationen bezüglich Druck, Position und Kontaktwinkel der Sonde möglichst gering zu halten.