Mikrofluidischen Mischern für ein Studium Proteinfaltung

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, zwei Lösungen schnell zu mischen, um eine biochemische Reaktion im Mikrosekundenbereich zu starten. Dies wird erreicht, indem zunächst ein mikrofluidischer Mischer hergestellt wird. Der zweite Schritt besteht darin, einen Chip mit einem Deckglas zu verbinden, um die Kanäle abzudichten.

Anschließend wird der Chip an ein Verteilerstück montiert, das die Lösungsreservoire enthält. Der letzte Schritt besteht darin, die gemischte Lösung mittels konfokaler Fluoreszenzmikroskopie abzubilden. Letztendlich wird die biochemische Reaktion auf der Mikrosekundenskala erfasst, indem die Distanz entlang des Auslasskanals in Zeit umgerechnet wird.

Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie der Stopp-Fluss-Mischung besteht darin, dass die Vermischung nicht durch Turbulenzen begrenzt ist und innerhalb weniger Mikrosekunden erfolgt. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich der Proteinfaltung zu beantworten, beispielsweise: Wann tritt der hydrophobe Kollaps auf? Die Durchführung des Verfahrens wird ling woo, ein Postdoktorand in meinem Labor, bei der Herstellung mikrofluidischer Mischchips demonstrieren.

Reinigen Sie zunächst vier Zoll große FU-Siliziumwafer mit frischer Piranha-Lösung gemäß dem schriftlichen Protokoll, das diesem Video beiliegt. Tragen Sie anschließend mithilfe eines Niederdruck-Chemische-Dampfabscheidungs-Ofens eine Polysiliziumbeschichtung auf, die pro jeweils geplante 10-Mikrometer-Tiefe der endgültigen mikrofluidischen Kanäle etwa einen Mikrometer dick ist. Nach weiterer Behandlung der Wafer gemäß der Beschreibung im Text beschichten Sie die Wafer mit einer 900 Nanometer dicken Schicht eines Z 52 14 Photoresists und führen anschließend eine Vorwärmung bei 90 Grad Celsius direkt auf einer Heizplatte für eine Minute oder im Ofen bei 110 Grad Celsius für 30 Minuten durch.

Nachdem eine Fotomaske ausgerichtet wurde, stellen Sie zunächst durch Bestrahlung des Fotolacks mit UV-Licht für mehrere Sekunden einen harten und vakuumdichten Kontakt her. Entwickeln Sie anschließend das Muster im Fotolack gemäß dem schriftlichen Protokoll. Untersuchen Sie die Strukturen auf dem Wafer mit einem Mikroskop und führen Sie eine Härtebehandlung direkt auf einer Heizplatte bei 115 Grad Celsius für zwei Minuten durch.

Als Nächstes plasmareinigen Sie die Wafer mit Asher oder Sauerstoffplasma für 2,5 Minuten bei einer HF-Leistung von 100 Watt. Ätzen Sie mithilfe eines tiefen reaktiven Ionenätzverfahrens die Polysiliciumschicht vollständig bis zur darunterliegenden Fused Silica durch. Entfernen Sie den verbleibenden Fotolack und reinigen Sie den Wafer gemäß den Anweisungen im Text.

Messen Sie die Ätztiefe, um sicherzustellen, dass das Poly-Coating vollständig durchgeätzt ist. Ätzen Sie Fused Silica mithilfe eines oxidfähigen Deep-Reactive-Ion-Ätzverfahrens auf eine Tiefe von etwa 10 Mikrometern pro Mikrometer Dicke des Poly-Coatings. Reinigen Sie das Wafer mit dem Matrix-Asher für vier Minuten bei einer HF-Leistung von 100 Watt und entfernen Sie das Polysilizium mit einem Xenon-Difluorid-Ätzer, bevor Sie Löcher in das Wafer bohren. Beschichten Sie es anschließend durch Spin-Coating mit einer neuen einmikronigen Schicht aus Photoresist, um die Kanäle während der weiteren Handhabung zu schützen.

Danach wird die Wafer-Oberfläche nach unten auf einer opfernden Glasplatte mit Aqua Bond 55 montiert. Achten Sie darauf, die Presse blasenfrei zu halten, und verwenden Sie eine computergesteuerte Diamantspitzen-Bohrmaschine mit Mikro-90-Reinigungslösung. Dadurch wird verhindert, dass kleine Glassplitter an den Kanälen haften bleiben, wodurch der Chip während des Gebrauchs verstopft werden könnte.

Bohren Sie anschließend Eintritts- und Austrittslöcher in jeden Chip. Spülen Sie den Wafer mit deionisiertem Wasser ab, wobei Sie mithilfe einer Spritze Wasser in jedes Loch injizieren. Danach für eine Stunde in Seifenwasser einweichen, nachdem das Foto entfernt wurde.

Widerstand und Haftvermittler wie im Text beschrieben aufbringen. Die Wafer mit deionisiertem Wasser und warmer Seifenlösung spülen. Jedes Loch erneut mit einer Spritze spülen, wobei nach dem Durchströmen des Wafers mit Stickstoff die geätzten Strukturen vermieden werden sollen.

Weiter im Vakuumofen bei 120 Grad Celsius trocknen. Die Bohrungen auf Freiheit von Schmutzpartikeln überprüfen und die Reinigungsschritte bei Bedarf wiederholen. Die folgenden Schritte sollten im Reinraum durchgeführt werden.

Messen Sie die Tiefe der Kanäle entweder mit einem optischen oder mechanischen Oberflächenprofilierer. Reinigen Sie den Wafer sowie ein Fusionsilicat-Deckglas wie im Text beschrieben in einem Reinraum. Trocknen Sie den Wafer gründlich mit Stickstoffgas für mindestens fünf Minuten.

Legen Sie dann die Wafer-Oberfläche mit der Struktur nach oben auf einen Stapel von drei bis vier Reinraumtüchern, die auf einer harten, flachen Oberfläche wie einer kleinen Glasscheibe liegen. Wiederholen Sie dies mit dem Deckglas. Heben Sie das Deckglas an der Kante an und drehen Sie es um, sodass die polierte Seite mit der Fläche nach unten über dem Wafer gehalten wird.

Richten Sie die flachen Kanten sorgfältig aus, legen Sie die Deckglasplatte auf die Wafer und lassen Sie sie sich setzen; justieren Sie nur durch horizontales Verschieben. Drücken Sie mit einem Finger in die Mitte des Wafers. Man sollte sehen, wie sich eine Bindungsfront nach außen ausbreitet.

Falls erforderlich, üben Sie zusätzlichen Druck auf andere Positionen rund um die Wafer aus, um die Ausbreitung der Bonding-Front voranzutreiben. Nach dem Einlegen der versiegelten Wafer in einen Hochtemperaturofen, der mit dem im Text angegebenen Temperaturprofil programmiert ist, schneiden Sie den Wafer mit einer Wafer-Trennsäge in einzelne Chips. Das Manifold zur Aufnahme des Mischchips und der Lösungen kann aus Kunststoff wie Lexan oder Plexiglas oder aus Aluminium hergestellt werden.

Für die Temperaturregelung befestigen Sie den Chip mithilfe kleiner O-Ringe am Verteiler und sichern Sie ihn mit einem Haltering, der eine klare optische Sicht auf die Mitte des Chips ermöglicht. Die O-Ring-Nuten sollten flacher als üblich sein, um einen guten Sitz sicherzustellen, ohne zu viel Druck auf den Chip auszuüben. Sobald der Chip montiert ist, fügen Sie Lösungen in die mittleren und seitlichen Reservoire hinzu und achten Sie darauf, eventuelle Blasen, die sich an der Unterseite der Vertiefungen festgesetzt haben, freizusetzen.

Platzieren Sie das Verteilerstück auf einem umgekehrten Mikroskop und untersuchen Sie den Mischbereich über die Okular- oder Kameraausgabe. Eine Glühlampe, die auf das Verteilerstück gestellt wird, liefert ausreichend Beleuchtung. Verwenden Sie einen Farbstoff oder eine Lösung mit hohem Brechungsindex im mittleren Kanal, um den Strahl sichtbar zu machen.

Da die in diesem Mischer verwendeten Volumina sehr gering sind, kann die Strömung durch Luftdruck gesteuert werden, der über den Lösungsbrunnen angelegt wird. Um den Strahl sichtbar zu machen, beginnen Sie mit einem Druck von null Pfund pro Quadratzoll im Seitenkanal und erhöhen Sie diesen langsam, bis er dem Druck im Zentralkanal entspricht. Falls ein Seitenkanal verstopft ist, wird der Strahl gegen eine der Wände des Auslasskanals gedrückt.

Wenn ein sichtbarer Verstopfung erscheint, kann diese durch Anlegen von Druck oder Vakuum an den Auslasskanal mit einer Spritze gelöst werden. Wenn Protein oder anderes organisches Material den Chip verstopft, kann dieser durch Einweichen in Piranha-Lösung über Nacht gereinigt werden. Führen Sie einen beschichteten Laserstrahl mithilfe eines dichroitischen Spiegels, der sich entweder innerhalb oder direkt außerhalb des Mikroskops befindet, in ein Mikroskop für Forschungszwecke ein.

Richten Sie den Laser so aus, dass der Fokus im Okular oder auf der Kamera etwa im Mischbereich sichtbar ist. Die Fluoreszenz des Proteins im Mischer wird vom Objektiv gesammelt und über einen Dichroischen Spiegel, der durch eine Linse fokussiert, auf eine Lochblende gelenkt und auf einem Photonenzähler abgebildet. Scannen Sie den Chip mit einem piezoelektrischen Scanner in x- und y-Richtung, um den Mischbereich abzubilden.

Wählen Sie eine Position auf dem Jet und scannen Sie in X- und Y-Richtung, um den Fokus in der vertikalen Mitte des Kanals zu finden. Die Schärfentiefe des Mikroskops ist deutlich geringer als die Kanaltiefe, und die Strömungsgeschwindigkeit ist im Kanal gleichmäßig, mit Ausnahme eines Bereichs von einem Mikrometer um die Wände herum. Daher wird die zeitliche Auflösung der beobachteten Fluoreszenz hauptsächlich durch die Größe des konfokalen Flecks bestimmt.

Scannen Sie horizontal innerhalb des Austrittskanals in 100-Mikrometer-Schritten entlang des Strahls, wobei an jeder Position etwa eine Millisekunde beobachtet wird. Bewegen Sie den Mikroskopständer um 80 bis 90 Mikrometer entlang des Strahls, um spätere Zeitpunkte aufzuzeichnen. Alternativ kann das Licht nach dem Dichroischen Spiegel mithilfe einer Linse, die das Licht auf den Eingangsschlitz fokussiert, von einem Spektrografen und einer CCD-Kamera detektiert werden.

Da die Datensammlung im Vergleich zum Photomultiplier langsamer ist, wird der Jet typischerweise zuerst mit dem Photomultiplier abgebildet und anschließend werden Punkte entlang des Jets mit dem Spektrografen gemessen. Die Daten des Photomultipliers werden analysiert, indem drei bis fünf Pixel um den Jet herum an jeder Position summiert werden, um eine Darstellung der Intensität in Abhängigkeit von der Entfernung zu erstellen. Die Zeit wird aus der Entfernung berechnet, indem eine berechnete Geschwindigkeit verwendet wird, die auf den angewendeten Drücken basiert.

Als abschließenden Schritt analysieren Sie die Daten des Spektrografen mit einer der im Text beschriebenen Methoden. Hier ist eine Konturdarstellung der Intensität im Mischbereich dargestellt, die mit dem Photomultiplier gemessen wurde. Das Hintergrundsignal im Auslasskanal außerhalb des Strahls sollte nahe an der Rauschuntergrenze des Detektors liegen und wird in der Regel nicht subtrahiert.

Ein höherer Hintergrund kann auf eine schlechte Ausrichtung oder darauf hinweisen, dass das Protein an den Wänden des Kanals haftet. Umgekehrt deutet ein verzerrter oder gekrümmter Strahl, insbesondere im Mischbereich, auf eine schlechte Ätzung der Düsen hin. Ein zeitaufgelöstes Spektrum wird gezeigt, aufgenommen von dem Protein ACell Coenzym-A-Bindeprotein oder A CBP, markiert mit Alexa 4 88 und Alexa 6 47.

Die grünen und roten Rechtecke zeigen die Wellenlängen an, die als Donor- bzw. Akzeptorkanäle bezeichnet sind. Diese Daten wurden einer Hintergrundsubtraktion unterzogen, um die Dunkelladung und das Lasersignal zu entfernen. Das Hintergrundsignal wurde bei einem mittleren Kanaldruck von null Pfund pro Quadratzoll aufgenommen.

Die Mischzeit kann durch die Messung einer schnellen Reaktion bestimmt werden, die wesentlich schneller abläuft als die Mischung, beispielsweise die Fluoreszenzlöschung von Tryptophan durch Kaliumiodid. Da der Strahl kleiner ist als die optische Auflösung des Mikroskops, tritt im Mischbereich ein starker Intensitätsabfall auf. Bei der Bildung des Strahls kann diese instrumentelle Antwort durch eine Kontrollmessung, bei der sich keine Lösungsbedingungen ändern, eliminiert werden.

Das Verhältnis von Mischungs- zu Nichtmischungsexperimenten der Fluoreszenz von N-Acetyl-Tryptophanamid ist in dieser Abbildung dargestellt. Die Linie zeigt die vorhergesagte Konzentration von Kaliumiodid basierend auf Multiphysik-Modellierungen und -Simulationen an der Konsole. Die Mischzeit, gemessen als die Zeit, die erforderlich ist, damit die Konzentration um 80 % abnimmt, beträgt acht Mikrosekunden.

Diese Darstellung zeigt die Änderungen des FRET-Signals im Protein A CBP nach der Verdünnung des Denaturans von sechs auf 0,06 molare Konzentration. Diese Daten benötigen kein Kontrollexperiment. Da das FRET bereits ein Verhältnis darstellt und die instrumentelle Antwort bereits entfernt wurde, repräsentiert der schnelle Anstieg in der Nähe von T gleich null eine rasche Änderung des FRET-Signals innerhalb der Mischzeit.

Nach dieser Entwicklung ebnete diese Technik den Forschern auf dem Gebiet der Proteinfaltung den Weg, um die frühesten Schritte bei der Bildung der Proteinstruktur zu untersuchen.