Die Analyse der zellulären Internalisierung Nanopartikel und Bakterien durch Multi-Spectral Imaging Durchflusszytometrie

Um die zellulären Mechanismen der Internalisierung von Nanopartikeln und Bakterien mittels multiskalarer bildgebender Durchflusszytometrie zu analysieren. Makrophagen werden zunächst mit Cytochalasin D vorbehandelt, um die Aktinpolymerisation zu hemmen. Anschließend werden Nanopartikel oder Salmonellen der Makrophagen-Monolayer hinzugefügt und inkubiert.

Anschließend werden die Makrophagen geerntet, fixiert und zur Analyse mittels eines Bildstroms markiert. Mit einem multispektralen bildgebenden Durchflusszytometer werden Zellen, die Nanopartikel und/oder Salmonellen aufgenommen haben, von solchen unterschieden, die nur oberflächengebundene Nanopartikel und/oder Salmonellen aufweisen. Die resultierenden Daten zeigen, dass sowohl Salmonellen als auch Nanopartikel ausschließlich von Zellen aufgenommen werden, die nicht mit Cyto klain behandelt wurden.

D, was darauf hindeutet, dass die Internalisierung aktinabhängig ist. Diese Technik bietet mehrere Vorteile gegenüber etablierten Methoden wie der Durchflusszytometrie und der konfokalen Mikroskopie. Vor allem liefert sie eine genaue Messung der Fluoreszenzsignalintensitäten und eine räumliche Auflösung zwischen verschiedenen zellulären Strukturen bei hoher Geschwindigkeit.

Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen sowohl der Forschung zu Biomaterialimpfstoffen und Arzneimitteldelivery als auch der Interaktionsstudien zwischen Wirt und Pathogen zu beantworten. Dazu gehört die Eingrenzung der Internalisierungswege, die von Polyanhydrid-Nanopartikeln und Bakterien genutzt werden. Im Allgemeinen haben Personen, die neu in dieser Methode sind, häufig Schwierigkeiten.

Es ist wichtig, ausreichend Zeit für die Titration der Farbstoffe aufzuwenden, um optimale Fluoreszenzsignale zu erzielen. Außerdem erfordert das Erlernen der Software und das Erstellen von Analysenvorlagen Zeit. Wir hatten die Idee zu dieser Methode erstmals, als wir feststellten, dass polyhydro Nanopartikel bei der Anwendung von Mikroskopie und anderen Techniken eigenschaftenähnlich wie Pathogene aufweisen.

Anschließend wollten wir ein Hochdurchsatzsystem, um die von Salmonella und den Pollenhydrid-Nanopartikeln verwendeten Internalisierungsprozesse vor der Durchführung des Assays zu vergleichen. Alle Kulturen von Säugetier- und Bakterienzellen sollten geerntet und Nanopartikelsuspensionen hergestellt werden. Beginnen Sie mit der Gewinnung konfluenter RAW264.7-Zellen mithilfe eines Zellabstreifers.

Bestimmen Sie die Zellanzahl mithilfe eines Hämozytometers. Anschließend werden die Zellen in einer 24-Well-Kulturplatte mit einer Dichte von 5 × 10⁵ Zellen pro Well in 0,5 Milliliter vollständigem DMEM ausplattiert und über Nacht bei 37 °C in einem 5 % CO₂-Inkubator inkubiert.

Zur Herstellung der Salmonella tarica-Dilution verdünnen Sie Salmonella in C-D-M-E-M, um eine Infektionsmultiplizität von hundert pro RA W2 64,7-Zelle in einem 16 × 125 mm großen, autoklavierbaren Glasröhrchen mit Schraubverschluss zu erreichen. Als Nächstes wiegen Sie mithilfe sterilisierter Watte fünf Milligramm 1 % FITC-markierter Polyanhydrid-Nanopartikel ab, die gemäß der Beschreibung von Rean und Kollegen in ihrer Veröffentlichung aus dem Jahr 2009 im Journal Pharmaceutical Research hergestellt wurden, und geben Sie diese in ein 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen. Geben Sie die Nanopartikel zu 0,5 Millilitern kalter phosphatgepufferter Kochsalzlösung hinzu und stellen Sie das Gefäß auf Eis.

Halten Sie das Reagenzglas auf Eis. Verwenden Sie einen Ultraschall-Zerkleinerer mit Mikrosonde, um die Suspension für etwa 25 Sekunden bei vier bis sechs Joule zu beschallen. Nun, da alle benötigten Zellen und Reagenzien bereitstehen, kann der Phagozytose-Assay durchgeführt werden.

Beschriften Sie 24-Well-Zellkulturplatten, die kultivierte RA W264.7-Zellen enthalten, zur Vorbereitung des Assays auf der ersten Platte. Jede der folgenden Proben wird im Triplikat analysiert: Cyto und D mit Nanopartikeln, Cyto und D mit Salmonellen, Medium mit Nanopartikeln, Medium mit Salmonellen, nur Nanopartikel, nur Salmonellen sowie AF660-gefärbte Zellen; nur vier Grad Celsius-Kontrollen werden auf der zweiten Platte analysiert und umfassen Medium plus Nanopartikel sowie Medium plus Salmonellen, die bei dieser niedrigen Temperatur inkubiert werden, um zelluläre Prozesse wie Phagozytose zu verlangsamen. Eine Stunde vor der Induktion fügen Sie fünf Mikrogramm pro Milliliter Cyto und D sowie C-D-M-E-M den entsprechenden Vertiefungen hinzu und inkubieren die Zellen bei 37 Grad Celsius.

Nach der Inkubation die Nanopartikelsuspension vortexen und 10 µL in die entsprechenden Vertiefungen geben. Anschließend den Salmonellenansatz vortexen und bei einem MOI von 100 in die entsprechenden Vertiefungen geben. Die Platte mehrmals leicht antippen, um zu mischen.

Danach die Probenplatten 45 Minuten lang bei 37 Grad Celsius und die Negativkontrollplatten bei vier Grad Celsius inkubieren. Nach der Inkubation die Platten auf Eis stellen, die Zellen zweimal mit eiskalter PBS ohne Calcium und Magnesium durch Aspiration des alten Mediums und Verwerfen desselben waschen, um nicht gebundene Partikel, Salmonellen sowie tote oder abgelöste Zellen zu entfernen. Verwendung von Petal Magnesium.

Das Vorwaschen mit PBS ist an diesem Punkt unerlässlich, da es die Ablösung der Zellen vom Substrat erleichtert. Um die Zellen zu gewinnen, 250 Mikroliter eiskalte PBS hinzufügen, die Vertiefungen vorsichtig abkratzen, die gesammelten Zellen in silikonisierte Mikrozentrifugenröhrchen mit Schnappdeckel überführen und auf Eis stellen. Die Zellen waschen, indem man ein Milliliter kalte Waschpuffer hinzugibt, anschließend bei 250 × g für 10 Minuten bei vier Grad Celsius zentrifugiert. Nach dem Entsorgen des Überstandes den restlichen Puffer entfernen, indem man das umgestülpte Mikrozentrifugenröhrchen auf Papier abstreift.

Suspendieren Sie das Zellpellet, indem Sie das Mikrozentrifugenröhrchen vorsichtig über ein Reagenzglasgestell ziehen. Zum Fixieren der Zellen geben Sie 100 µL 4 %iger Paraformaldehyd-Lösung in PBS hinzu und lassen die Zellen 15 Minuten stehen. Waschen Sie die Zellen bei Raumtemperatur, indem Sie ein Milliliter Perm-Waschpuffer hinzufügen, und zentrifugieren Sie anschließend 10 Minuten bei 250 ×g und 4 °C.

Nach dem Verwerfen des Überstandes entfernen Sie die restliche Pufferlösung wie zuvor. Danach färben Sie die RA W2 64.7-Zellen. Für Aktin geben Sie 100 µL Perm-Waschpuffer mit Alexa Fluor foid in sechs 60 für 15 Minuten hinzu.

Bei Raumtemperatur sollten die ungefärbten Proben mit Perm inkubiert werden, gewaschen mit Waschpuffer ohne Phin. Nach der Färbung sollten die Zellen erneut gewaschen und zentrifugiert sowie anschließend in 50 Mikroliter PBS mit 1 % PFA resuspendiert werden. Die Probe ist bis zur Messung dunkel bei vier Grad Celsius zu lagern. Einschalten, Bildstrom und Start.

Aktivieren Sie die Fluidik und initialisieren Sie sie über das Dateimenü. Wählen Sie „Standardvorlage laden“. Wählen Sie im Bildkatalog über das Ansichtsmenü „Alle“ aus und klicken Sie gegebenenfalls auf „Setup starten“, um die Aufnahme der Perlen zu beginnen. Passen Sie bei Bedarf die Kernverfolgung an, um die Bilder seitlich zu zentrieren.

Wählen Sie den Hellfeldkanal aus und klicken Sie auf Intensität festlegen. Warten Sie, bis der Variationskoeffizient der Fließgeschwindigkeit konstant unter 0,2 % liegt. Gehen Sie zum Reiter „Assist“ und klicken Sie auf „Alle starten“, um Kalibrierungen und Tests durchzuführen, und überprüfen Sie, dass alle im Software-Check bestanden wurden. Klicken Sie anschließend auf Probe laden.

Dann platzieren Sie auf Anweisung das Gefäß mit der stärksten Probe. Bei allen Fluorchromen im Probenlader wählen Sie eine 40x-Vergrößerung. Sobald die Geräteeinstellungen festgelegt sind, ändern Sie diese während des gesamten Experiments nicht mehr.

Schalten Sie jeden Laser im Experiment ein, indem Sie auf die Laser-Symbole in der Software klicken, und stellen Sie die Laserleistung so ein, dass jede Fluorochrom max. Pixelwerte zwischen 104.000 Zählungen aufweist, gemessen anhand der Streudiagramme. Um die Erfassung unerwünschter Objekte zu vermeiden, klicken Sie auf das Fenster der Zellklassifizierung in der Software. Um ausschließlich Zelldaten zu erfassen, wählen Sie den unteren Grenzwertbereich für Kanal eins des Hellfelds aus und setzen Sie den Wert auf 50 Mikrometer; Objekte mit einer Fläche von weniger als 50 Mikrometern gelten als Zelltrümmer und werden nicht erfasst.

Wählen Sie die Kanäle aus, die erfasst werden sollen, indem Sie in der Software hier die entsprechenden Kanal-Symbole anklicken. Unter der Registerkarte „Setup“ sind die Kanäle 1, 2, 3, 4, 5 und 6 ausgewählt. Geben Sie die Dateinummer und den Zielordner ein.

Stellen Sie die Sequenznummer auf eins und die Anzahl der zu erfassenden Ereignisse auf 5.000 ein. Klicken Sie auf „Run“, um die Durchführung zu starten, und erfassen und speichern Sie die Datendatei des ersten Experiments. Klicken Sie auf FLL und führen Sie die nächste experimentelle Probe aus.

Wiederholen Sie dies, bis alle experimentellen Proben gesammelt wurden. Klicken Sie anschließend zur Durchführung der Kontrollen auf „Comp Einstellungen“. Dadurch wird das Hellfeld und der Streulaser abgeschaltet und die Erfassung aller Fluoreszenzkanäle unter dem Reiter „Erfassen“ ermöglicht.

Ändern Sie den Eingabewert auf 500. Danach platzieren Sie das Kontrollröhrchen und klicken Sie auf „Ausführen“. Erfassen Sie 500 positiv gefärbte Zellen in einfach gefärbten Kontrollen.

Wiederholen Sie dies für jeden Fluorochrom im Experiment, um eine Kompensationsmatrix zu erstellen. Nachdem alle Probenbilder aufgenommen wurden, starten Sie die ideas-Analyse-Software auf einem separaten Analysecomputer, indem Sie zweimal auf das ideas-Symbol auf dem Desktop klicken. Doppelklicken Sie auf den Internalisierungs-Assistenten und laden Sie eine der Testproben-RIF-Dateien.

Ein Popup-Fenster zeigt Anweisungen zum Laden der Testdateien. Befolgen Sie die Anweisungen und klicken Sie auf die Schaltfläche „Weiter“. Danach klicken Sie auf „Neue Matrix“.

Dadurch wird der Kompensationsassistent gestartet. Wählen Sie, wenn dazu aufgefordert, die Datendateien für die Einzelfarben-Kontrollen aus, um sie hinzuzufügen. Klicken Sie im Assistenten weiter, und folgen Sie den Anweisungen, bis die Kompensationsmatrix-Datei gespeichert und im zweiten Schritt des Internalisierungs-Assistenten in das Feld geladen wird.

Klicken Sie auf „Weiter“ und folgen Sie den Anweisungen, bis eine DAF-Datei generiert wird. Legen Sie die Anzeigeeigenschaften des Bildes fest, indem Sie die während der Aufnahme verwendeten Bildkanäle auswählen. Klicken Sie auf Kanal zwei für FITC und auf Kanal fünf für AF 60.

Hellfeld und Seitenstreulicht sind standardmäßig ausgewählt. Wählen Sie den Hellfeldkanal O zur Darstellung der Zellgrenze und den Kanal O2, in dem Nanopartikel oder Bakterien für die Internalisierungsprobe erfasst wurden, um die Einzelzellpopulation zu definieren. Es wird ein Streudiagramm der Hellfeldfläche gegen das Hellfeld-Aspektverhältnis aller Zellen erstellt. Für die hochdurchsatzfähige Analyse mehrerer Datendateien ist eine Vorlagendatei erforderlich, weshalb es von entscheidender Bedeutung ist, die Gates sorgfältig bei der Erstellung der Vorlagendatei zu definieren.

Jeder Punkt repräsentiert die Werte eines einzelnen Zellbildes. Klicken Sie auf einen einzelnen Punkt in einem Diagramm, um das Bild dieser bestimmten Zelle in der Bildergalerie auszuwählen.

Zeichnen Sie als Nächstes ein Tor um Zellen mit der Fläche und dem Seitenverhältnis, das einzelnen Zellevents entspricht. Einzelne Zellen weisen ein Seitenverhältnis von etwa eins auf, Doppelzellen hingegen ein Seitenverhältnis von etwa 0,5.

Klicken Sie mehrere Zellen an, um zwischen dem Bereich mit Einzelzellen und Doppelzellen oder Trümmern zu unterscheiden. Erstellen Sie ein Histogramm der quadratischen Mittelwerte des Hellfeld-Gradienten des Hellfeldbilds. Klicken Sie auf die Schaltfläche Weiter.

Dann wählen Sie unter der Registerkarte „Population“ die Option „Bin“, um den ausgewählten Bin anzuzeigen. Klicken Sie auf die Bins, um die Zellen und die beste Fokusebene zu bestimmen. Beginnen Sie damit, eine linienförmige Region zu zeichnen, um fokussierte Zellen zu erfassen.

Je höher der Gradient-RMS-Wert, desto besser ist die Fokussierung; überspringen Sie den nächsten Schritt, es sei denn, es müssen weitere Färbungen berücksichtigt werden. Ein neues Streudiagramm der Intensität des zweiten Kanals auf der X-Achse gegenüber dem maximalen Pixelwert des zweiten Kanals auf der Y-Achse wird erstellt. Klicken Sie auf die Punkte und betrachten Sie die Bilder, um den Bereich zu bestimmen, der um die Zellen, die positiv für Nanopartikel oder Bakterien sind, eingezeichnet werden soll.

Ein Histogramm der Internalisierungseigenschaft wird mit einem Bereich erzeugt, der bei null beginnt und durch Betrachtung der Bilder angepasst werden sollte. Die Internalisierungseigenschaft ist ein Verhältnis der Intensität innerhalb der Zelle zur Intensität der gesamten Zelle. Sie ist so skaliert, dass bei einem Wert von null die Hälfte der Intensität im Inneren liegt.

Der Assistent hat einen Bereich jeder Zelle erstellt, der das Innere definiert, indem er eine Maske erzeugt, die verwendet wird, um basierend auf dem Zellbild die Zelloberfläche zu finden, und diese anschließend um vier Pixel verkleinert hat. Beachten Sie, dass diese Maske bei Bedarf manuell für verschiedene Zelltypen angepasst werden kann, indem zunächst eine Objektm Maske auf dem Hellfeldbild erstellt und diese um mehr oder weniger Pixel verkleinert wird. Die Internalisierungs-Charakteristik wird anhand dieser verkleinerten Objektm Maske mithilfe eines Algorithmus in der Software berechnet.

Diese Funktion ermöglicht es uns, internalisierte Partikel und Bakterien, deren fluoreszierendes Signal überwiegend innerhalb der Maskengrenze liegt, von an der Oberfläche gebundenen Partikeln und Bakterien zu unterscheiden, deren fluoreszierendes Signal überwiegend außerhalb der Maskengrenze liegt, wie in diesem Beispiel gezeigt. Erstellen Sie ein neues Histogramm mit einer neuen Internalisierungs-Funktion basierend auf der erodierten Objektmaske. Zeichnen Sie einen Bereich, um eine Gate auf internalisierte Zellen zu setzen, indem Sie die Aufnahme im ausgewählten Bin-Modus betrachten. Setzen Sie das Gate bei 0,3. Hier.

Zellen mit einem Wert unter 0,3 gelten als Oberflächen-gebundene Partikel-positive Zellen. Um Zellen mit Hintergrundanfärbung auszuschließen und spezifisch internalisierte Nanopartikel oder Bakterien zu identifizieren, wählen Sie Merkmale aus dem Analysemenü aus. Klicken Sie auf das Analysemenü.

Klicken Sie anschließend auf die Spot-Zähl-Funktion neben der Schaltfläche, um die mittlere Spot-Anzahl dem Statistikbericht hinzuzufügen. Gehen Sie im Berichtemenü auf das Berichtesymbol. Definieren Sie dann den Statistikbericht, fügen Sie Spalten hinzu und wählen Sie die entsprechende Zellpopulation aus.

Klicken Sie auf „Okay“. Der Assistent für die Internalisierung fügt diesem Bericht automatisch statistische Daten hinzu, um die Datei als Vorlagendatei zu speichern, die für die Batch-Analyse aller experimentellen Dateien verwendet werden kann. Klicken Sie auf das Dateimenü und wählen Sie „Speichern unter Vorlage“.

Vorlagendateien. Haben die Erweiterung dot AST, um mehrere Datendateien in der Idea-Software zu analysieren. Klicken Sie auf „Werkzeuge“ und wählen Sie „Datendateien im Batchverfahren“ aus, und geben Sie alle RIF-Dateien ein.

Fügen Sie die Kompensationsmatrix-Datei und die Vorlagendatei in den entsprechenden Abschnitten hinzu, um den Batch zur Verarbeitung einzureichen, und klicken Sie auf „Einreichen“. Nach dem Verarbeitungsschritt werden alle RAF-Dateien analysiert und für jede der einzelnen Rohdateien DAF-Dateien generiert. Ein abschließender Bericht wird mit Statistiken für alle Proben erstellt, um den Effekt der Aktin-Hemmung und niedriger Temperatur auf die Phagozytose von Salmonellen und Nanopartikeln zu vergleichen.

RA W2 64.7-Zellen wurden bei 37 Grad Celsius in Medium entweder mit oder ohne Cytochalasin D inkubiert oder in Medium bei vier Grad Celsius inkubiert. Sowohl die Temperatur als auch die Aktin-Manipulationen verringerten die Internalisierung sowohl von Nanopartikeln als auch von Salmonellen. Allerdings erhöhte die Inkubation der Zellen mit Cytochalasin D den Prozentsatz der Zellen mit an der Oberfläche gebundenen Nanopartikeln, während der Prozentsatz der Zellen mit an der Oberfläche gebundenen Salmonellen abnahm.

Der Prozentsatz an Zellen, die positiv für an der Oberfläche gebundene Nanopartikel waren, stieg von etwa 8 % bei 37 Grad Celsius auf über 35 % nach Behandlung entweder mit Cyto und D oder bei vier Grad Celsius. Im Gegensatz dazu verringerte sich der Anteil der Zellen mit an der Oberfläche gebundenen Salmonellen von 35 % auf 15 % nach Cyto-und-D-Behandlung. Die Inkubation von RA W2 64.7-Zellen mit Salmonellen bei vier Grad Celsius führte zu einer verminderten Internalisierung, ohne dass ein offensichtlicher Anstieg der Menge an oberflächengebundenen Bakterien im Vergleich zur Kontrolle bei 37 Grad Celsius beobachtet wurde. Insgesamt zeigen diese Daten, dass Salmonellen und Nanopartikel durch einen ähnlichen zellulären Prozess internalisiert werden, der Aktin benötigt und temperaturabhängig ist.

Außerdem zeigen die Daten, dass eine dauerhafte Anheftung von Salmonellen an Makrophagen die Aktinpolymerisation erfordert. Nach dem Anschauen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie die zelluläre Aufnahme von Nanopartikeln und Bakterien mittels multiskalierender bildgebender Durchflusszytometrie untersucht wird. Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig zu bedenken, dass Inhibitoren zytotoxisch sind.

Daher sind vorherige Experimente zur zytotoxischen Profilierung erforderlich, um die optimalen zu verwendenden Konzentrationen zu bestimmen. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit Salmonellen gefährlich sein kann; Vorsichtsmaßnahmen wie das Tragen der geeigneten persönlichen Schutzausrüstung und das Vermeiden der Bildung von Aerosolen sollten bei der Durchführung dieses Verfahrens beachtet werden.