Retrograde Fluoreszenzmarkierung Ermöglicht Gezielte Extracellular Einzel-Einheit Aufnahme von identifizierten Neuronen

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, die Aktivität einzelner Neuronen in vivo von einer identifizierten neuronalen Population in einem nicht-genetischen Modellsystem aufzuzeichnen. Dies wird erreicht, indem zunächst eine Kraniotomie durchgeführt wird, um die gewünschte Hirnregion freizulegen. Im zweiten Schritt werden Wolframdrähte verwendet, um den fluoreszierenden Farbstoff in dem Areal abzugeben, in das die Zielneurone projizieren.

Danach wird der Farbstoff retrograd transportiert, was zu einer selektiven Markierung der Projektionsneurone führt. Der letzte Schritt besteht darin, aus dem markierten Axon des einzelnen Projektionsneurons aufzuzeichnen. Letztendlich kommen Einzelzell-Außenelektrodenableitungen zum Einsatz, um zu zeigen, wie zentrale sensorische Neurone in einer intakten Verschaltung auf sensorische Reize in vivo reagieren.

Mit dieser Methode lassen sich zentrale Fragen dazu beantworten, wie neuronale Schaltkreise Unterschiede in der zeitlichen Abfolge synaptischer Eingänge im Submillisekundenbereich wahrnehmen. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden liegt in der Möglichkeit, gezielt einzelne Neuronen oder sogar Axone sowie nicht-genetisch zugängliche Systeme anzusteuern. Wöchentliche elektrische Fische verwenden elektrische Signale zur Kommunikation und Navigation.

Sie unterscheiden Signale verschiedener Fische anhand von Unterschieden im Bereich von Submillisekunden in der zeitlichen Abfolge synaptischer Eingänge. Wir untersuchten, wie die vermuteten Zeitvergleichsneuronen in ihrer elektrischen Sinnesbahn derart kleine Zeitunterschiede detektieren können. Diese Technik kann jedoch auch auf andere Systeme wie visuelle und auditorische Sinnesbahnen angewendet werden.

Es ist besonders schwierig, Flüssigkeit aus diesen Zellen zu entnehmen, aufgrund der geringen Größe, der dichten Umhüllung im umgebenden Gewebe und der präsynaptischen Endigungen, die den größten Teil des Zellleibes bedecken. Die intrazelluläre Farbstoffinjektion während einer Ganzzellableitung markiert in vitro eine einzelne Zelle, um gezielte Ableitungen von diesem Axon zu leiten. Ebenso ermöglicht der retrograde Transport nach extrazellulärer Farbstoffinjektion eine selektive Markierung der Projektionsneurone in oberflächlichen Hirnregionen.

Dies kann zur visuellen Unterstützung bei in vivo-Einzel-Einheits-Ableitungen verwendet werden. Um die D-kodierte Nadel vorzubereiten, elektrolytisch zunächst einen Wolframdraht mit einem Durchmesser von 160 Mikrometern auf einen endgültigen Nadelspitzen-Durchmesser von fünf bis 50 Mikrometern spitzen. Anschließend die Nadelspitze am Abend vor dem Experiment mit einer zwei Millimolar-Lösung eines 10.000 Molekulargewicht aufweisenden Dextran-Alexa-Floor-Farbstoffs markieren, um eine Vollnarkose auszulösen.

Stellen Sie den Fisch in Beckenwasser mit MS 222-Lösung bei 300 Milligramm pro Liter, um den Fisch zu immobilisieren und elektrisch zu stillen, indem Sie 100 Mikroliter Flail bei drei Milligramm pro Milliliter in die dorsale Körpermuskulatur injizieren. Füllen Sie als Nächstes die Ableitungskammer mit Beckenwasser und legen Sie den Fisch mit der Bauchseite nach unten auf die Plattform in der Mitte der Kammer. Leiten Sie dann die belüftete MS 222-Lösung bei 100 Milligramm pro Liter mit einer Geschwindigkeit von ein bis zwei Milliliter pro Minute zu, indem Sie eine Pipettenspitze in den Mund einführen.

Anschließend stabilisieren Sie den Fisch mit festen Stäben und Wachs auf beiden Seiten des Körpers. Überwachen Sie den Gesundheitszustand des Fisches, indem Sie den kontinuierlichen Blutfluss in den Augengefäßen und eine normale Körperfarbe überprüfen. Drehen Sie dann die Plattform entlang der vertikalen Achse.

Stellen Sie ein Ende der Plattform so ein, dass eine Seite der dorsalen Fläche des Fischkopfes über der Wasseroberfläche liegt, während der Rest des Fischkörpers unter Wasser bleibt. Legen Sie ein kleines Stück Kim-Tuch auf jeden nicht untergetauchten Hautbereich, um Austrocknung zu verhindern. Tragen Sie in diesem Verfahren 0,4 % Lidocain auf die freiliegende Kopffläche mit einem Wattestäbchen auf.

Verwenden Sie dann eine Skalpellklinge, um ein rechteckiges Stück Hautgewebe von etwa drei Millimetern mal fünf Millimetern für einen 6,2 cm langen Fisch zu schneiden. Die seitliche Kante des Rechtecks sollte mit der Mitte des Auges übereinstimmen. Die vordere Kante des Rechtecks sollte unmittelbar hinter dem Auge liegen, und die mediale Kante des Rechtecks sollte unmittelbar seitlich zur Mittellinie liegen.

Entfernen Sie anschließend das Rechteck mit einer Pinzette. Schneiden Sie zusätzlich ein 2,5 Millimeter großes Quadrat anterior mely zu, um den Schädel freizulegen. Entfernen Sie durch Abschaben jegliches überschüssige Gewebe mit der Skalpellklinge, um die freigelegte Schädelfläche vollständig zu reinigen.

Trocknen Sie die Oberfläche anschließend vollständig mit einem Kim-Tuch und Druckluft. Kleben Sie danach einen Metallpfosten mit Sekundenkleber auf den vorderen medialen, freiliegenden Schädelpart. Warten Sie, bis der Kleber vollständig getrocknet ist.

Verwenden Sie einen Zahnarztbohrer mit einer Kugelbohrer-Karbidspitze mit 0,5 Millimeter Durchmesser, um ein Rechteck von etwa zwei Millimetern mal vier Millimetern auf dem Schädel eines 6,2 Zentimeter langen Fisches aufzuzeichnen. Danach schneiden Sie den Umfang des Rechtecks mit dem Skalpell und der Pinzette aus. Anschließend wird der Schädel abgezogen.

Um das Gehirn freizulegen, schneiden Sie sowohl das pigmentierte Dura mater als auch das klare Pia mater mit einer Feder-Schere oder einer Nadel durch. Entfernen Sie anschließend die durchtrennten Anteile mit einer Pinzette, um den anterior extra lateralen Kern und den posterior extra lateralen Kern freizulegen. Positionieren Sie nun einen Manipulator mit einer zuvor präparierten D-beschichteten Nadel über dem Zielbereich, der die interessierenden Axone enthält.

Der hintere extra laterale Kern wird in unserem Fall schnell von der Nadel um etwa 25 Mikrometer in das Gewebe eingedrungen. Nachdem sich der Farbstoff 15 bis 30 Sekunden lang ausgebreitet hat, ziehen Sie die Nadel zurück. Wiederholen Sie den Vorgang bei Bedarf mit zusätzlichen frischen Nadeln.

Platzieren Sie jeden an einer unterschiedlichen Stelle, sodass sich der Farbstoff im Zielbereich verteilt. Anschließend spülen Sie den überschüssigen Farbstoff mit Hickman-Ringer-Lösung aus der Kammer aus und warten mindestens zwei Stunden, um die Aufnahme und den Transport des Farbstoffs abzuwarten. Um die gewünschten Axone sichtbar zu machen, stellen Sie die Aufnahmekammer mit dem Fisch unter das Objektiv eines aufrechten, feststehenden Epi-Fluoreszenzmikroskops.

Wechseln Sie die Atmungslösung zu frischem Beckenwasser und halten Sie die gleiche Flussrate aufrecht. Danach bringen Sie ein Ende des Erdungsdrahts in der freigelegten Gehirnhöhle an und verbinden das andere Ende mit der Masse der Aufzeichnungs-Headstage. Als Nächstes platzieren Sie ein Paar Ableitelektroden neben der Schwanzbasis.

Verbinden Sie dann die Elektroden mit einem Differenzverstärker und einer Aufnahmeeinrichtung. Um den Befehl für die elektrische Organausschüttung (EODC) zu überwachen, erstellen Sie eine maßstabsgetreue Skizze des Gehirnareals, die bei geringer Vergrößerung betrachtet wird, und fügen Sie dabei wichtige Blutgefäße als Orientierungspunkte hinzu, um die genaue Lage der markierten Axone zu bestimmen. Um die Platzierung von D zunächst zu bestätigen, betrachten Sie das gesamte Gewebe mit Hellfeldbeleuchtung, um sich zu orientieren.

Danach unter fluoreszierender Beleuchtung betrachten. Der hintere laterale Extra-Kern sollte eine diffuse Färbung aufweisen. Anschließend unter hoher Vergrößerung den vorderen lateralen Extra-Kern mit den Gefäßen als Orientierungspunkte lokalisieren.

Beleuchten Sie es mit fluoreszierendem Licht, während Sie mit einer Kapillarglaskolbenwandstärke von einem Millimeter Außendurchmesser und 0,58 Millimeter Innendurchmesser aus Borosilikatglas mit Filament in der Nähe der Oberfläche nach einem markierten Axon suchen. Ziehen Sie eine Ableitelektrode mit einem fünf Millimeter langen schmalen Schaft und einem Elektrodenöffnungsdurchmesser von etwa ein bis 2,4 Mikrometer.

Füllen Sie die Elektrode mit filtrierter Hickman-Ringer-Lösung. Der endgültige Elektrodenwiderstand sollte im Bereich von 16 bis 155 Megaohm liegen. Setzen Sie die Elektrode in einen Elektrodenhalter mit Druckanschluss.

Verbinden Sie es mit der auf einem Manipulator montierten Kopfstufe. Anschließend verbinden Sie die Kopfstufe mit einem Verstärker. Eine analoge Digital-Aufnahmeeinheit, die nicht dargestellt ist, verbindet den Verstärker mit dem Computer.

Anschließend 30 Millibar positiven Druck auf die Elektrodenleitung ausüben. Die Elektrode langsam von der Gewebeoberfläche aus in Richtung des Axons voranbewegen. Wenn die Elektrode sich nahe am Axon befindet, sollte der positive Druck eine geringe, aber wahrnehmbare Bewegung des Axons verursachen, während die Elektrode neben dem Axon liegt.

Notieren Sie die Aktivität während der Präsentation der Testreize. Obwohl ein elektrisches Artefakt die korrekte Aufnahme und Stimulation bestätigt, sollten keine Aktionspotenziale auftreten. Lösen Sie den äußeren Druck in der Elektrode und wiederholen Sie die Stimulation und Aufnahme.

Üben Sie dann leichtes Absaugen aus, wodurch das Axon in die Elektrode hineinbewegt wird. Wiederholen Sie die Stimulations- und Aufnahmeschritte erneut. Nun sollten Sie einige Aktionspotentiale als Reaktion auf die Stimuli sehen.

Sobald Aktionspotentiale sichtbar sind, schließen Sie die Druckleitung. Wenn alle gewünschten Ableitungen abgeschlossen sind, wechseln Sie das Beckenwasser zurück zur Atemlösung mit MS 222 in einer Konzentration von hundert Milligramm pro Liter, um sicherzustellen, dass der Fisch vollständig anästhesiert ist. Es sollte mindestens 10 Minuten lang kein EODC nachweisbar sein, bevor der Fisch euthanasiert wird.

Hier sind fünf Beispieltracings, die die Aktionspotentiale zeigen, die durch einen 0,1 Millisekunden langen, sechs Millivolt pro Zentimeter starken, monophasischen, kontralateral positiven transversalen Rechteckimpuls hervorgerufen wurden, sowie ein Rasterplot, der die Spiketimepunkte während von 20 Wiederholungen eines 75-Millisekunden-Aufnahmezeitfensters für dieselbe Einheit darstellt, die zum Zeitpunkt null mit sechs Millivolt pro Zentimeter gereizt wurde. Die Dauerstrecke ist rechts aufgeführt. Dargestellt ist hier eine Stimulusdauertuningkurve, die die Antworten als Spikes pro Stimuluswiederholung quantifiziert.

Wenn die chirurgische Technik und die Farbstoffinjektion einmal beherrscht sind, können sie bei korrekter Durchführung innerhalb einer Stunde durchgeführt werden, und die Ableitungen können zwei bis drei Stunden nach der Farbstoffinjektion beginnen. Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, die Gesundheit des Versuchstieres im Anschluss sorgfältig zu überwachen. Weitere Methoden wie die Zweiphotonen-Bildgebung können durchgeführt werden, um Aktivitäten von Neuronen in noch tiefer liegenden Hirnstrukturen aufzuzeichnen.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man Einzelzellantworten aus einer identifizierten neuronalen Zellpopulation markiert und aufzeichnet.