Aufzeichnung der elektrischen Aktivität von identifizierten Neuronen im intakten Gehirn von transgenen Fischen

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, die elektrischen Aktivitäten von Neuronen in einem intakten Fischgehirnpräparat aufzuzeichnen. Dazu wird ein vier bis sechs Monate alter transgener Meca-Fisch in MS 2 22 zunächst betäubt und dann sein Gehirn präpariert. Als nächstes wird eines der interessierenden Neuronen, die durch GFP markiert sind, mit einer Aufzeichnungselektrode kontaktiert und seine elektrischen Aktivitäten werden durch die Elektrophysiologie eines losen Patches oder einer Ganzzell-Patch-Klemme aufgezeichnet.

Letztendlich können die Ergebnisse Veränderungen in der Feuerfrequenz von Aktionspotentialen oder Veränderungen des Membranpotentials als Reaktion auf verschiedene Behandlungen im intakten Gehirn zeigen. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden, wie z. B. der Elektrophysiologie von Zellen und Kulturen oder der Präparation von Gehirnschnitten, besteht darin, dass wir die elektrischen Eigenschaften von Neuronen in einer gesamten Gehirnpräparation mit intakten neuronalen Schaltkreisen charakterisieren können. Obwohl diese Messungen einen Einblick in die reproduktive Neuroendokrinologie geben, können sie auch auf die anderen Neurosysteme angewendet werden, indem sie Forschungsfische wie Neuronen verwenden, die die Motivation und das affektive Verhalten steuern.

Diese Demonstration verwendet transgene Meca-Fische, bei denen GnRH drei Neuronen genetisch mit GFP markiert sind: Um mit der Anästhesie eines erwachsenen Maka zu beginnen, indem es in fünf Milliliter MS 2 22 getaucht wird. Ein paar Minuten, nachdem die Kiemenbewegungen aufgehört haben, geben Sie es in eine 60-Millimeter-Petrischale mit Fischsalzlösung. Nun mit einer Schere den Fisch am verhätschelten Ende des Alauns enthaupten.

Den Kopf in eine Petrischale mit einem Durchmesser von 35 Millimetern geben, die zur Hälfte mit Fischsalzlösung gefüllt und mit Yl Guard ausgekleidet ist. Die Schale benötigt eine zentrale Vertiefung, in der der Kopf mit der Rückenseite nach oben mit Insektennadeln und einer feinen Schere positioniert und gesichert wird. Schneide den dorsalen Teil des Schädels vorsichtig um seinen Umfang herum auf.

Entfernen Sie dann vorsichtig den Schädel mit einer Pinzette, wodurch der dorsale Teil des Gehirns, einschließlich des vorderen Teils des Rückenmarks, freigelegt wird. Heben Sie nun das Rückenmark vorsichtig mit einer Pinzette mit feiner Spitze an und durchtrennen Sie dann die beidseitigen Bindenerven mit einer feinen Schere. Dazu gehört die Durchtrennung der Hirnnerven, der Spinalnerven, der ventralen Sehnerven und der vorderen Riechnerven.

Legen Sie das vollständig präparierte Gehirn in eine neue, mit frischer Fischsalzlösung gefüllte Petrischale unter einem Mikroskop. Überprüfen Sie sorgfältig, ob das gesamte Gehirn und die Hypophyse intakt sind und nicht geschnitten oder durchstochen wurden. Entsorgen Sie alle beschädigten Gehirne und beginnen Sie erneut mit einer Nadel.

Geben Sie einen kleinen Tropfen schnell wirkenden Kleber wie Cyanacrylat in die Mitte der Aufnahmekammer. Verteilen Sie den Leimtropfen auf einem Quadratzentimeter. Übertragen Sie dann schnell das Gehirn auf den Kleber.

Befestigen Sie es mit der Bauchseite nach oben. Füllen Sie nun die Aufnahmekammer mit etwa einem Milliliter Fischsalzlösung, um das Gehirn zu bedecken. Entfernen Sie mit der Pinzette mit der feinen Spitze vorsichtig die Hirnhäute über der Oberfläche des Aufzeichnungsbereichs des Gehirns.

Perfundieren Sie das Gehirn kontinuierlich mit belüfteter Fischsalzlösung mit einer Geschwindigkeit von mindestens 200 Mikrolitern pro Minute. Stellen Sie einige Mikroelektroden aus Glas mit sechs bis 10 Megaohm her und füllen Sie sie etwa zur Hälfte mit loser Patch-Recording-Lösung auf. Mit einem aufrechten Fluoreszenzmikroskop und einer gekühlten CCD-Kamera finden Sie den GFP-exprimierenden terminalen Nerv gn RH drei Neuronen, beginnend mit dem 10-fach-Objektiv.

Wechseln Sie dann zum 40-fach-Objektiv und lokalisieren Sie die Neuronen an oder in der Nähe der ventralen Oberfläche der Riechkolben direkt vor dem Cephalon. Wechseln Sie nun zu einem Videomonitor, der Echtzeitbilder vom Mikroskop liefert. Der Neuronencluster enthält acht bis 10 GnRH-Neuronen.

Positionieren Sie die Mikroelektrode mit der Elektrodenspitze über dem Zielneuron in das Aufzeichnungskammerbad. Üben Sie konstant leichten Überdruck aus, damit die Mikroelektrode nicht verstopft. Nähern Sie sich dem Zielneuron vorsichtig mit der Spitze der Elektrode, überprüfen Sie und überwachen Sie den Elektrodenwiderstand mit der Axo-Transplantatsoftware.

Bei Verwendung des Dichtheitstests im Spannungsklemmenmodus ändert sich der Elektrodenwiderstand an dieser Stelle leicht, wenn sich die Spitze der Elektrode auf der Oberfläche des Neurons befindet. Lassen Sie den Überdruck ab, um eine Abdichtung mit niedrigem Widerstand herzustellen, wenn erforderlich, wird ein leichter Unterdruck ausgeübt. Der wichtigste Schritt für eine gute Aufzeichnung ist die Auswahl eines sauberen Neuroarms, der Ihnen helfen kann, eine ideale Abdichtung zwischen den Elektroden und derselben Membran herzustellen.

Wechseln Sie nun in den Stromzangen-Modus. Öffnen Sie das Diagramm, ein Power-Lab-Programm, und beginnen Sie mit der kontinuierlichen Aufzeichnung der Membranspannung ohne Stromzufuhr, passen Sie die Spannungsskala und die Aufzeichnungsrate an, falls erforderlich, und zeichnen Sie die elektrische Grundaktivität in normaler Fischsalzlösung etwa fünf Minuten lang auf, bevor Sie Behandlungen durchführen. Die Badperfusion von Medikamenten, Hormonen, Peptiden usw. sollte dem Gehirnpräparat zugesetzt werden, das mit 200 Mikrolitern pro Minute fließt.

Verwenden Sie dann normale Fischsalzlösung für eine Auswaschphase, nachdem Sie eine Zelle lokalisiert haben, überprüfen Sie und überwachen Sie den Elektrodenwiderstand im Spannungsklemmmodus. Wenn sich die Spitze der Elektrode auf der Oberfläche des Neurons befindet und sich der Elektrodenwiderstand leicht ändert. Lassen Sie den Überdruck ab und üben Sie einen kleinen Unterdruck aus, um eine hochohmige Abdichtung auf dem Neuron zu erzeugen.

Wenden Sie einen sanften Mundsauger an. Reißen Sie die geflickte Zellmembran. Der Widerstand fällt sofort auf etwa 120 bis 250 Megaohm ab, wenn die Membran bricht.

Wechseln Sie nun in den Stromzangenmodus und erfassen Sie die Membranspannung kontinuierlich anhand eines Diagramms ohne Stromeingang. Passen Sie auch hier die Spannungsskala und die Aufzeichnungsrate nach Bedarf an. Nachdem Sie etwa fünf Minuten lang eine Basisaufzeichnung der elektrischen Aktivität in normaler Fischsalzlösung durchgeführt haben, wenden Sie Behandlungen an, gefolgt von einer Auswaschphase. Die spontanen elektrischen Aktivitäten der Neuronen des Moca-terminalen Nervs GNRH wurden im Stromklemmenmodus aufgezeichnet.

Die typische Zündrate beträgt 0,5 bis sechs Hertz. Potentiale feuern typischerweise in einem tonischen oder schlagenden Muster mit einem ziemlich regelmäßigen Interspike-Intervall, das Interspike-Membranpotential liegt im Durchschnitt bei etwa minus 48 Millivolt. Dieser experimentelle Ansatz ist auch erfolgreich bei der Aufzeichnung von GFP-markierten GNRH-Neuronen, die sich im Vorderhirn von adulten transgenen Neuronen befinden.

Elektrische Aktivität des Zebrafisch-Neurons im exzidierten intakten Gehirn von transgenen. Zebrafische wurden auf ähnliche Weise wie für einen DACA beschrieben durch lose Flecken erfasst. Die gleichen Techniken ermöglichten auch die Aufzeichnung ganzer Zellen.

Anders als bei den GnRH-Neuronen des Meca-terminalen Nervs ist das Muster der spontanen Aktion, des potentiellen Feuerns von Zebrafisch-GnRH-Neuronen im präoperativen Bereich, im ventralen Cephalon und im Hypothalamus oft unregelmäßig. Diese Technik kann in einer Stunde für eine 15-minütige Aufnahme durchgeführt werden, wenn Sie richtig arbeiten. Viel Glück.