Polymerase Chain Reaction: Basic Protocol Plus Fehlersuche und Optimierungsstrategien

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, die Schritte der Polymerase-Kettenreaktion oder PCR zu demonstrieren, mit deren Hilfe eine ausreichende Menge eines spezifischen DNA-Abschnitts aus einer geringen Ausgangsmenge an Material hergestellt werden kann. Zunächst werden die für die PCR-Reaktion verwendeten Reagenzien und Materialien zusammengestellt, dann wird das Reaktionsgemisch angesetzt, das die vier Desoxyribonukleotide, die DNA-Vorlage, die Primer und die DNA-Polymerase enthält. Anschließend werden die thermischen Zyklenbedingungen programmiert und die PCR-Reaktion durchgeführt.

Danach die Ergebnisse überprüfen, um zu bestimmen, ob die Reaktion erfolgreich war. Letztendlich sollte eine Polymerase-Kettenreaktion ein spezifisches Amplikon der gewünschten Produktgröße ergeben.

Im Allgemeinen haben Personen, die neu bei diesem Protokoll sind, etwas Schwierigkeiten mit der Berechnung der einzelnen variablen Reagenzien, und manchmal treten Probleme beim Pipettieren auf, insbesondere mit den korrekten Volumina des Polymerase-Enzyms, das Glycerin enthält. Beginnen Sie das Experiment mit einem frisch befüllten Eisbehälter. Tragen Sie Handschuhe, um die Reaktion vor Kontaminationen zu schützen.

Zusammensetzung und Reagenzien. Stellen Sie die PCR-Bestandteile auf Eis, um sie vollständig aufzutauen. Dazu gehören DNA-Template, Primer, DNA-Polymerase, 10× Reaktionspuffer mit oder ohne Magnesiumchlorid, Desoxynukleotide, sterilem Wasser und Magnesiumchlorid.

Das Magnesiumchlorid ist erforderlich, wenn der Puffer ohne Magnesiumchlorid verwendet wird. Stellen Sie eine 96-Well-Platte in einen Eisbehälter, um als Halter für die 0,2-Milliliter-dünnwandigen PCR-Röhrchen zu dienen. Rüsten Sie nun den Arbeitsplatz mit PCR-Röhrchen und Deckeln aus.

Ein PCR-Röhrchenständer, ein alkoholresistenter Marker und ein Satz Mikropipetten. Erstellen Sie immer eine Tabelle der Reagenzien, in der die Reaktionsmischung mit steriler, destillierter Wasserlösung zur Erzielung eines Endvolumens von 50 Mikrolitern detailliert aufgeführt ist. Zum Beispiel fünf Mikroliter eines Puffers ohne Magnesium, ein Mikroliter 10-Millimolar-dNTPs und ein optimiertes 4,0-Millimolar-Magnesium.

Ein Mikroliter jedes 20 Mikromolar-Primers, 0,5 Mikroliter einer zwei Nanogramm pro Mikroliter betragenden Vorlage und 0,5 Mikroliter Polymerase erfordern lediglich 33 Mikroliter sterilem Wasser. Fügen Sie Magnesiumchlorid hinzu, falls es nicht im 10×-Puffer enthalten ist oder für die PCR-Optimierung benötigt wird.

Etikettieren Sie die PCR-Röhrchen mit einem alkoholresistenten Stift für jedes Reaktionsröhrchen. Geben Sie zuerst die berechneten Mengen sterilen Wassers hinzu, anschließend 10× Puffer und 10 Millimolar dNTPs. Bei dieser Reaktion führen wir eine Titration mit Magnesiumchlorid durch.

Da die Magnesiumkonzentration nicht konstant sein wird, wird Magnesiumchlorid einzeln den PCR-Röhrchen zugegeben, und das Volumen wird mit sterilen Wasser auf 10 Mikroliter adjustiert, sodass jeweils 40 Mikroliter der endgültigen Master-Mix-Lösung zu jedem PCR-Röhrchen hinzugefügt werden. Um die 50-Mikroliter-Reaktion zu vervollständigen, werden anschließend die DNA-Vorlage und die Primer zugegeben. Abschließend werden pro 50-Mikroliter-Reaktion 0,5 bis 2,5 Einheiten DNA-Polymerase in ein 1,8-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen gegeben.

Bereiten Sie eine Master-Mix-Lösung in ausreichender Menge vor, um sowohl Kontrollen als auch Pipettierverluste abzudecken. Stellen Sie einen Mikropipettierer auf etwa die Hälfte des Gesamtvolumens der Lösung ein und mischen Sie vorsichtig durch mehrmaliges Auf- und Abpipettieren. Geben Sie für jede Testprobe die eloquente Master-Mix-Lösung in ein PCR-Röhrchen.

Verwenden Sie nun für die negative Kontrolle ohne Matrizen-DNA alle Reagenzien und kompensieren Sie das fehlende DNA-Volumen mit steriler Wasser. Verwenden Sie für die positive Kontrolle ein Set aus Matrizen-DNA und Primern, das unter denselben Bedingungen wie die experimentellen PCR-Proben ein bekanntes Fragment amplifiziert. PCR-Thermocycler erwärmen und kühlen die Reaktionsmischung schnell, wodurch eine hitzeinduzierte Denaturierung der Doppelstränge, die Annealing der Primer an die Plus- und Minusstränge der DNA-Matrize sowie die Verlängerung des PCR-Produkts ermöglicht wird.

Die Verweilzeiten im Thermocycler richten sich nach der Größe der Vorlage und dem GC-Gehalt der DNA gemäß der allgemeinen Formel. Beginnen Sie mit einer initialen Denaturierung der Vorlage und führen Sie anschließend 25 bis 35 Zyklen eines dreistufigen Temperaturzyklusprogramms durch. Der erste Schritt dieser Zyklen dient der Denaturierung der DNA-Vorlage.

Danach für optimal eine Annealing-Temperatur von etwa fünf Grad Celsius unterhalb der scheinbaren Schmelztemperatur der Primer programmieren, gefolgt vom Verlängerungsschritt, um die Polymerase an die DNA-Vorlage zu binden und das PCR-Produkt zu synthetisieren. Geben Sie nun die Anzahl der Zyklen ein. Als Nächstes programmieren Sie den nächsten Schritt.

Ein verlängerter Verlängerungsschritt zur Vervollständigung der Synthese der Amplifikate. Schließen Sie abschließend einen Abbruchschritt ein, bei dem die Mischung auf vier Grad Celsius abgekühlt wird. Falls Standard-PCR-Bedingungen das gewünschte Amplifikat nicht ergeben, ist eine Optimierung der PCR erforderlich, um bessere Ergebnisse zu erzielen.

Wenn die Reaktionen beim ersten Mal nicht funktioniert haben, sollten Sie versuchen, die Reaktion zu überprüfen. Zunächst sollten Sie sicherstellen, dass das Problem nicht auf einen menschlichen Fehler zurückzuführen war. Dies könnte beispielsweise auftreten, wenn ein Pipettierfehler vorliegt oder wenn Sie vergessen haben, einen Reagenz zur Probe hinzuzufügen, und zwar in einem der Reagenzgläser.

Danach können Sie versuchen, einige der Stringenzbedingungen zu verändern, indem Sie beispielsweise die Einstellungen des Thermocyclers anpassen, oder alternativ die Magnesiumkonzentration verändern. Außerdem können Sie dem Reagenz Zusatzstoffe hinzufügen, um Probleme zu beheben. Als vielseitige Modifikation kommt zudem die Hot-Start-PCR in Betracht, bei der die initiale Denaturierungszeit deutlich verlängert wird.

Die AROS-Gelelektrophorese wird anschließend verwendet, um die PCR des GAL-Drei-Gens aus der genomischen DNA von S. seia aufzutrennen, um die optimale Magnesiumionenkonzentration für diesen Satz von Reagenzien zu bestimmen. Beachten Sie, dass ein PCR-Produkt der erwarteten Größe – 2098 Basenpaare – ab einer Magnesiumkonzentration von 2,5 Millimolar erscheint, wobei die optimale Konzentration bei vier Millimolar liegt. Bei unterschiedlichen DNA-Vorlagen erfordert die Amplifikation des gewünschten PCR-Produkts als diskrete Bande zwei Millimolar Magnesium. Die Verringerung der Stringenz der Reaktion unter wirksam suboptimale Amplifikationsbedingungen führt zu einem Smear unspezifischer Produkte.

Außerdem wird aufgrund der insgesamt geringeren Stringenz der Reaktion eine geringere Menge an Magnesiumionen benötigt, um ein Amplikon-Ikon zu bilden. Daher kann die Optimierung der PCR unter Berücksichtigung der Variablen das gewünschte diskrete Produkt erzeugen. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man eine Polymerase-Kettenreaktion einrichtet und vorbereitet.

Das Ziel besteht darin, die Variablen jeder PCR zu verstehen und zu ermitteln, wie sie manipuliert werden können, um das gewünschte Amplikon zu erzeugen.