Multiplexed Fluorometric Immunoassay Testing Methodology und Fehlerbehebung

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments besteht darin, Antikörper gegen zufällig vorkommende infektiöse Erreger in Laboratoriumstieren nachzuweisen. Dies wird erreicht, indem man das Testserum mit antigenbeschichteten Mikrokügelchen inkubiert. Anschließend wird das Serum mit einer biotinylierten, artsspezifischen Anti-Immunglobulin-Markierung inkubiert, die beliebige Antigen-Antikörper-Immunkomplexe erkennt.

Anschließend wird eine mit Streptavidin markierte FICO eryn Fluor force-Lösung hinzugefügt, um biotinylierte Immunglobuline nachzuweisen. Die erhaltenen Ergebnisse zeigen den positiven oder negativen Antikörperstatus gegenüber häufigen Erregern bei Laborrodentien, basierend auf multiplexen Fluoreszenz-, Immunoassay-Nettoscore- und fluoreszenten Probenwerten. Der Hauptvorteil dieser Methode im Vergleich zu etablierten Verfahren wie ELISA liegt darin, dass es sich bei MFIA um ein Multiplex-Assay handelt. Dies ermöglicht es einem Forscher, bis zu hundert verschiedene Assays in einem einzigen Test durchzuführen.

Nun, diese Technik verringert die Menge an verwendeten Serumproben und Einwegartikeln im Vergleich zu bestehenden Methoden und erhöht gleichzeitig die Menge an Informationen, die aus einem einzigen Test gewonnen werden können. Die Idee, diese Methode anzuwenden, kam uns erstmals, als wir eine große Anzahl von Serumproben auf mehrere Erreger testeten und sowohl den Arbeitsaufwand als auch die Testdauer reduzieren wollten. Die Durchführung des Verfahrens wird Donna Cohen demonstrieren, eine leitende Technologin aus unserem Labor. Zunächst bereiten Sie zwei Puffer vor, die für das Multiplex-Fluoreszenz-Immunoassay-Verfahren (MFIA) benötigt werden.

Das erste ist ein primärer Verdünnungspuffer, der von Charles River erhältlich ist und proprietäre Blockierstoffe enthält, um unspezifische Wechselwirkungen im Waschpuffer für den Assay zu verringern. Bereiten Sie eine Lösung von PBS mit 1 % BSA, pH 7,4, zu, um Partikel zu entfernen. Filtern Sie den Puffer mithilfe eines 0,2-Mikron-Flaschenaufsatzfilters in sterile, beschriftete Behälter unter Verwendung des Waschpuffers für den Assay.

Bereiten Sie zwei x Konzentrationen von biotinylierten Antispezies, IGG oder BAG sowie Strep AVID und FICO Erything oder SPE vor, die zur Markierung der Antigen-Antikörper-Komplexe verwendet werden, die während des Inkubationsschritts mit Testserum gebildet werden, um Proben der folgenden Materialien und Einwegartikel vorzubereiten: mehrkanalige und einkanalige Mikropipetten sowie Spitzen und 96-Loch-Mikrotiterplatten mit geringer Proteinbindung für die Proteindilution. Nach der Sammlung von Blutproben und der Isolierung des Serums vortexen Sie das Serum kurz, bevor Sie die Proben in einem 96-Loch-Mikrotiterplatten im Primärverdünnungspuffer verdünnen, um eine ordnungsgemäße und gleichmäßige Entleerung der Brunnen sicherzustellen. Benetzen Sie jeden Brunnen der 96-Loch-Testplatte vorab mit dem Assay-Waschpuffer und aspirieren Sie die Lösung langsam während des gesamten Assays.

Die Aspiration sollte fünf bis zehn Sekunden dauern, um eine Aggregation der Perlen und deren Verdichtung in der Filtermembran zu verhindern, da beides die Messdauer am Ende des Assays verlängern kann. Überprüfen Sie, ob der Flüssigkeitsablauf gestoppt ist, indem Sie die Unterseite der Testplatte mit Papiertüchern abtupfen. Es ist wichtig, die Testplatte nach jedem Waschschritt abzutupfen, um ein Nachfließen aus den Vertiefungen während der Inkubation zu verhindern.

Um die Kügelchen vorzubereiten, beginnen Sie damit, die gelagerte gekoppelte Kügelchensuspension zu wirbeln. Anschließend werden sie kurz in einem Bad beschallt. Es ist entscheidend, die Kügelchen ordnungsgemäß wieder in Suspension zu bringen, um aggregierte Kügelchenansammlungen zu vermeiden, die zu längeren Messzeiten führen können.

Nächste Stufe: Die 20 x-Stammsuspension in eine 2 x Arbeitsperlsuspension im primären Verdünnungsmittel auffüllen. Anschließend 50 Mikroliter der 2 x Perlsuspension in jedes Testloch der vorbenetzten Testplatte pipettieren. Je 50 Mikroliter der jeweiligen 2 x Test- und Kontrollseren entsprechend einer vordefinierten Plattenkarte auf die Testplatte übertragen.

Befestigen Sie den Deckel auf der Platte. Bedecken Sie sie mit Aluminiumfolie und inkubieren Sie die Testplatte 60 Minuten lang auf einem horizontal schwingenden Schüttler bei Raumtemperatur, um eine Verdunstung der Lösungen zu vermeiden, die den Erfolg des Assays beeinträchtigen könnte. Halten Sie die Testplatte während aller Inkubationsschritte mit dem Plattendekel bedeckt.

Außerdem sollte die Schüttelgeschwindigkeit höher als 400, aber niedriger als 700 U/min sein, damit die Perlen in Suspension bleiben und die Serumantikörper Zugang zu allen Oberflächen der gekoppelten Antigene haben. Nach dem Waschen der Platte in sequenziellen Inkubationen der Perlen mit BAG und SPE die Proben erneut waschen. Anschließend die Perlen wieder aufschwemmen, indem 125 µL Assay-Waschpuffer zugegeben werden, und zwei Minuten lang schütteln, um die Platte auszulesen.

Platzieren Sie es innerhalb von 10 Minuten nach der Resuspendierung der Beads in den Assay-Reader; die Beads passieren nacheinander einen Detektor, in dem sie zwei Lasern ausgesetzt werden. Ein Laser regt die internen Farbstoffe an, die den Farbsatz der Beads identifizieren, und der andere regt den FICO-Erything-Reporterfarbstoff an. Die Intensität der FICO-Erything-Fluoreszenz für eine vorbestimmte Anzahl von Beads wird als FM-FI-Wert gemeldet. Lesen Sie die erste Vertiefung, um zu überprüfen, dass das ausgewählte Bead-Panel mit dem Bead-Profil in den Testvertiefungen übereinstimmt.

Wenn Perlen außerhalb ihres vorgesehenen Perlenbereichs auf der Protokollanzeige erscheinen, wurde eine falsche Profilauswahl getroffen. Richtig resuspendierte Perlen füllen ihre spezifischen Bereiche gemäß der Angabe in der Assay-Lesersoftware aus. Wenn die Perlen aggregiert sind, füllen sie ihre Bereiche nur langsam aus.

Sie können die Testplatte aus dem Reader nehmen und die Vertiefungen manuell resuspendieren, um die Beads zu trennen. Entfernen Sie die Testplatte aus dem Reader und pipettieren Sie mit einem Mehrkanalpipettiergerät jede Vertiefung drei bis vier Mal auf und ab. Danach stellen Sie die Testplatte wieder in den Reader und setzen die Ergebnisprüfung fort.

Berichten Sie über Fehler wie unzureichende Bead-Zahlen oder abfallende IgG-anti-IgG-Bead-Scores und wiederholen Sie den Assay für diese Proben. Nach dem Export der Daten in Excel und der Berechnung der netto MFI ermitteln Sie, ob eines der Testspiel-Assay-Kontrollen ausgeschlossen werden muss, mit Ausnahme des Immuserums im hohen Bereich. Alle fehlgeschlagenen Kontrollen sind inakzeptabel, und der Assay muss wiederholt werden.

Diese Tabelle zeigt Daten für Testserum und Assay-Kontrollen von einer typischen Assay-Platte. Alle IgG-Kontrollen waren erfolgreich. Die Testergebnisse für diese Platte zeigen, dass zahlreiche gewebereaktive Proben und IgG-Kontrollproben fehlgeschlagen sind, wie in den orangefarbenen Vertiefungen zu sehen ist.

A1C eins und F1 zeigen einen TC-Gewebereaktivitätsausfall an, wobei die TC-Wertung in Klammern angegeben ist; Wells B eins und E eins veranschaulichen die beiden Arten von IgG-Interna-Steuerungsausfällen, unzureichendes Testantikörper- oder Testreagenz, BAG bzw. SPE. Die Testplatten-Ergebnisse werden nur interpretiert, wenn die Systemtauglichkeitskontrolle und die Serumkontrolle die hier gezeigten Akzeptanzkriterien erfüllen. Mikrokügelchen, beschichtet mit artenspezifischen Anti-Testserum-Immunglobulinen, können aufgrund unzureichender Probenmenge, zu hoher Probenverdünnung, falscher Art oder der Verwendung von Serum eines immundefizienten Wirts ungenügende Werte aufweisen.

Wenn die Ergebnisse der Testspiel-Assay-Kontrolle zufriedenstellend sind, werden die individuellen Assay-Ergebnisse gemäß dem Folgenden klassifiziert. Nach diesem Verfahren sollten wir zusätzliche Methoden wie ELISA, IFA und/oder Western Blot verwenden, um unerwartete oder positive Befunde zu bestätigen. Es ist entscheidend, diese Ergebnisse zu verifizieren, bevor Entscheidungen über die Tierhaltung getroffen werden.

Dies kann durch die Anwendung unterschiedlicher Methoden auf derselben Probe oder auf zusätzlichen Proben derselben Kolonie erfolgen. Nach dem Ansehen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man den multiplexen fluorimetrischen Immunoassay durchführt und die in Ihrer Einrichtung gewonnenen Ergebnisse interpretiert. Dies ermöglicht es Ihnen, den Arbeitsaufwand zu reduzieren und gleichzeitig mehr Informationen aus jedem Testprobengefäß zu gewinnen.