Anpassung von Aspergillus niger Morphologie durch Zugabe von Talkum Mikropartikel

Diese Methode erzeugt und charakterisiert mikropartikelabhängige morphologische Strukturen des fadenförmigen Pilzes Aspergillus niger, um die Pilzmorphologie mit der Produktivität zu korrelieren. Kultivieren Sie acht Aspergillus niger-Stämme mit oder ohne Mikropartikel in einem dreiliter Rührkessel-Bioreaktor über einen Zeitraum von 72 Stunden, um die spezifische Produktivität zu berechnen. Entnehmen Sie Proben zu definierten Zeitpunkten und bestimmen Sie die Biomasse, die Trockenmasse sowie die Veto-Fructo-Sase-Aktivität.

Nach 72 Stunden untersuchen Sie die Pilzmorphologie mittels Mikroskopie und charakterisieren Sie diese durch digitale Bildanalyse. Kombinieren Sie anschließend relevante Parameter der Bildanalyse zu einer Morphologiekennzahl, die mathematisch mit der spezifischen Produktivität korreliert ist. Letztendlich ermöglicht diese Methode die präzise Erzeugung und umfassende Charakterisierung der Morphologie von Aspergillus niger, um das Verständnis der Morphogenese fadenförmiger Mikroorganismen zu verbessern.

Aspergillus niger ist seit mehreren Jahrzehnten ein wichtiges industrielles Arbeitstier in der Biotechnologie. Eine der faszinierendsten und oft schwer beherrschbaren Eigenschaften von Aspergillus, niger und verwandten Arten ist ihre komplexe Morphologie, die je nach Kulturbedingungen von dichten sphärischen Pellets bis hin zu viskosen Mycelien reicht. Der Hauptvorteil unseres Verfahrens liegt darin, dass wir durch die Zugabe von Mikropartikeln nun in der Lage sind, die Pilzmorphologie gezielt an die jeweiligen Prozessanforderungen anzupassen.

Bisher wurde keine andere Methode für eine derartige Anpassung der Pilzmorphologie beschrieben. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen zur Kultivierung filamentöser Mikroorganismen zu beantworten. Denn für die industrielle Anwendung ist es entscheidend, die Pilzmorphologie zu kontrollieren und zudem zwischen einer gut und einer schlecht produzierenden Pilzmorphologie unterscheiden zu können.

Unser Protokoll bietet die Möglichkeit einer gezielten Anpassung und Charakterisierung der Pilzmorphologie. Obwohl diese Methode Einblicke in die Morphologie von Aspergillus niger ermöglicht, kann sie ebenso auf andere fadenförmige Mikroorganismen wie Penicillium- oder Strepto-Stämme angewendet werden. Richten Sie vier Bioreaktoren für sterile Kulturen gemäß des begleitenden Protokolls ein.

Text basierend auf der Zugabe von Mikropartikeln, kultivieren Sie Aspergillus niger mit unterschiedlicher Morphologie. Überführen Sie nach 72 Stunden 50 Milliliter Kulturbrühe in ein Falcon-Röhrchen.

Biomasseproben sind nach dem Trocknen im Exsikkator mindestens im Duplikat zu entnehmen; wiegen Sie einen Zellulosefilter mit der Mikrowaage. Setzen Sie den Filter in ein Büchner-Trichter ein, verbinden Sie ihn mit einer Wasserstrahlpumpe und filtrieren Sie 10 Milliliter Probe, gefolgt von 10 Milliliter entionisiertem Wasser, um Mediumsbestandteile von der Biomasse zu entfernen; falten Sie den Filter danach einmal in der Mitte.

Legen Sie es in eine Glas-Petri-Schale und in einen Trockenschrank, bis Gewichtskonstanz erreicht ist. Überführen Sie den Filter in einen Exsikkator und lassen Sie ihn abkühlen. Anschließend bestimmen Sie das Gewicht.

Berechnen Sie das Trockengewicht der Biomasse pro Liter durch Ermittlung des Gewichtsunterschieds der Filter und anschließende Division durch das Probenvolumen für die Glucose-Oxidase- und Peroxidase-Enzymassays. Lagern Sie die Proben auf Eis unter Verwendung einer Spritzenpassage, 1,5 Milliliter. Kultur-Suspension durch einen Celluloseacetat-Filter in ein Reaktionsröhrchen leiten, um den Beta-Fructo-SASE-Assay durchzuführen.

Sorgfältig stellen wir die statistische Robustheit mit zwei Proben im Triplikat sicher. Um den Assay zu starten, geben Sie 20 Mikroliter Probe in das Reagenzglas. Als Kontrolle für die pH- und temperaturabhängige Spaltung von Saccharose zu Glukose verwenden Sie 20 Mikroliter deionisiertes Wasser anstelle von 20 Mikroliter Probe. Bereiten Sie außerdem für jede Probe eine negative Kontrolle für verbleibendes Glukose im Kulturmedium durch den Assay vor.

20 Mikroliter hitzeinaktivierte Probe. Um die Umsetzung von Saccharose zu Glukose einzuleiten, 200 Mikroliter einer 1,65-molaren Saccharoselösung hinzufügen. Bei pH 5,4 die 20 Mikroliter Probe ansatzweise in einem Heizblock bei 40 Grad Celsius 20 Minuten lang inkubieren. Die Reaktion durch 10-minütiges Erhitzen auf 95 Grad Celsius nach Abkühlen der Röhrchen auf Eis beenden.

Zentrifugieren Sie die Proben nach Bedarf und verdünnen Sie die Proben für den Assay so, dass die gemessene Absorption im kalibrierten Wertebereich liegt. Geben Sie nun für jede Reaktion zwei Mikroliter Probe in eine Mikrotiterplatte. Führen Sie die Probemessungen im Triplikat durch.

Bereiten Sie außerdem eine Standardkurve für 10 Glucoselösungen im Bereich von einem Millimolar bis 15 Millimolar vor. Verwenden Sie für die Kalibrierung des Nullpunkts zwei Mikroliter entionisiertes Wasser. Geben Sie anschließend 200 Mikroliter der Reagenzlösung zu jedem Ansatz.

Die Probe 10 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. Die Absorption bei 450 Nanometern mit einem 96-Well-Sunrise-Mikroplattenreader und der Magellan-Software zur Datenauswertung messen. Das Ergebnisdiagramm mit einer Tabellenkalkulation öffnen und eine Kalibriergerade für die Standardkurve erstellen.

Berechnen Sie die Aktivität für jede Probe. Anschließend ermitteln Sie die Beta-Fructo-tase-Aktivität, indem Sie die Werte der entsprechenden Negativkontrolle von der Probenaktivität subtrahieren. Schließlich berechnen Sie die spezifische Produktivität unter Berücksichtigung des Trockengewichts der Biomasse und der Beta-Fructo-sase-Aktivität.

Geben Sie drei Milliliter Kultur-Suspension in eine Plastik-Petrischale und verdünnen Sie mit physiologischer Kochsalzlösung, um morphologische Strukturen zu separieren. Die Qualität der mikroskopischen Aufnahmen ist von außerordentlicher Bedeutung. Achten Sie bei der anschließenden Bildanalyse sorgfältig auf den Verdünnungsschritt.

Platzieren Sie die Petrischale unter einem Mikroskop mit integrierter Kamera. Nehmen Sie etwa 100 Bilder morphologischer Strukturen pro Probe auf und speichern Sie diese, wobei sichergestellt werden muss, dass auf jedem Bild mindestens ein Objekt vollständig abgebildet ist. Setzen Sie die Aufnahme auf dieselbe Weise mit Schalen fort, die Proben aus verschiedenen Reaktoren enthalten, und fertigen Sie jedes Mal neue Bilder an.

Beachten Sie die unterschiedlichen morphologischen Wachstumsformen von Proben aus verschiedenen Reaktoren, die mit unterschiedlichen Mengen an zugesetztem Talkumpulver gezüchtet wurden. Öffnen Sie dann alle Bilder derselben Probe im Bildverarbeitungsprogramm Image J. Verwenden Sie das Werkzeug „Prozess“, um ein Binärbild zu erstellen.

Wandeln Sie die Bilder in Schwarzweiß um, um den Befehl auf eine ganze Bilderserie anzuwenden. Verwenden Sie anschließend einen Makrocode und öffnen Sie eines der Bilder, das einen Maßstabsbalken enthält. Zeichnen Sie eine gerade Linie über den Maßstabsbalken, um die Anzahl der Pixel zu bestimmen, die 2000 Mikrometer entsprechen.

Wählen Sie das Analysewerkzeug aus, legen Sie die Messung fest und wählen Sie die Formfaktoren, Feret-Durchmesser, Fläche und Umfang. Verwenden Sie einen Makrocode, um eine Reihe von Bildern zu verarbeiten. Öffnen Sie nun die Tabelle, die die Ergebnisse der Formfaktorwerte darstellt.

Berechnen Sie für jedes Bild eine Morphologie-Nummer für alle Bilder einer Probe. Ermitteln Sie den Mittelwert der Morphologie-Nummer. Verwenden Sie ein Programm zur grafischen Darstellung und Datenanalyse, um die Morphologie-Nummer gegen die spezifische Produktivität aufzutragen.

Bestimmen Sie die mathematische Beziehung durch mathematische Regression mittels Zugabe steigender Konzentrationen von Talk-Mikropartikeln. Acht Niger SKAN 10 15. Die Morphologie verändert sich von einer echten Pellet-Morphologie hin zu einer dispergierten oder sogar my-Morphologie, da unter Standardbedingungen die erwartete Pellet-Morphologie auftritt.

Interessanterweise wird die myceliale Morphologie durch die Zugabe von 10 Gramm pro Liter Talkum-Mikropartikeln zum Medium erzeugt. Gleichzeitig steigt die Aktivität der Beto-Fructo-Tase um etwa das Dreifache. Die Zugabe von ein oder drei Gramm pro Liter Talkumpulver führt zu einer dispergierten Morphologie mit einer verdoppelten Fructose-Aktivität, wobei die Parameter durch automatische Bildanalyse bestimmt wurden. Die mikropartikelabhängige Morphologie kann umfassend durch Morphologie beschrieben werden.

Die Anzahlnotiz, die bei glatten Pellets perfekt rund ist, erscheint in mikroskopischen Aufnahmen als perfekte Kreise für derartige Partikel. Die Morphologiezahl hat unter Standardbedingungen einen Wert, der eins annähert. Die Morphologie in Reaktor eins weist eine Morphologiezahl von etwa 0,8 auf.

Die Morphologie im Reaktor vier mit 10 Gramm pro Liter Talkumpulver weist eine Morphologiekennzahl von etwa 0,1 auf. Die Morphologiekennzahl für die Reaktoren zwei und drei mit Talkumpulverkonzentrationen von ein und drei Gramm pro Liter liegt zwischen diesen Extremen und zeigt eine dispergierte Morphologie.

Da die von Mikropartikeln abhängige Morphologie eng mit der Produktivität der Beta-Fruktose-Zellen verknüpft ist, besteht nach ihrer Entwicklung eine gute mathematische Korrelation zwischen Morphologie, Anzahl und Produktivität. Diese Technik ebnete den Weg für Forscher im Bereich der Biotechnologie, die Pilzmorphologie und insbesondere deren Beziehung zur Produktivität weiter zu erforschen. Anhand dieses Verfahrens zur detaillierten Erzeugung spezifischer morphologischer Pilz-Kreuztypen können auch andere wichtige Aspekte der Kultivierung filamentöser Mikroorganismen untersucht werden.

Die mycelielle Morphologie ist beispielsweise bekanntermaßen viel zäher als die Palisadenmorphologie. Daher wird die Gesamtproduktivität des Verfahrens durch Probleme und die Aufreinigung des gewünschten Produkts beeinträchtigt. Unsere Morphologiezahl wird dazu beitragen, Modelle im Hinblick auf Kultur, Prothetik und das allgemeine Verständnis der Pilzmorphologie weiterzuentwickeln.