Detektion von fluoreszierenden Nanopartikel Wechselwirkungen mit primären Immun-Zell-Subpopulationen durch Durchflusszytometrie
28. März 2014
Analyse der Nanopartikel Wechselwirkung mit definierten Untergruppen der Immunzellen durch Durchflusszytometrie.
Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, fluoreszierende Nanopartikel-Wechselwirkungen mit primären Immunzell-Subpopulationen mittels Durchflusszytometrie zu detektieren. Dies wird erreicht, indem zunächst die interessierenden Zellen mit den Nanopartikeln behandelt werden. Im nächsten Schritt werden die Zellen mit Antikörpern gegen zellspezifische Oberflächenmarker markiert und anschließend mittels Durchflusszytometrie analysiert.
Letztlich kann die Interaktion der Nanopartikel mit einzelnen Immunzellpopulationen gemessen werden. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie der Mikroskopie besteht darin, dass mit dieser Technik Variationen der Fluoreszenzintensitäten, die durch Nanopartikel induziert werden, in nicht adhärenten Zellpopulationen quantifiziert werden können. Für die Internalisierung von Nanopartikeln in Blutleukozyten oder gereinigten Monozyten beginnen Sie mit der fünfmaligen Beschichtung von 10 bis zum Fünftel der interessierenden Zellen in einem Milliliter pro Vertiefung. In jeder Vertiefung einer 12-Well-Platte.
Geben Sie dann 10 Mikroliter frisch vorbereitete fluoreszierende Siliziumdioxid-Nanopartikelsuspension in jede Versuchsvertiefung und fügen Sie zu diesem Zeitpunkt auch den unbehandelten Kontrollvertiefungen das gleiche Volumen des vollständigen Mediums hinzu. Nach einer einstündigen Internalisierung bei 37 Grad Celsius werden die Proben in einzelne 1,5-Milliliter-Polypropylen-Röhrchen überführt und dann die Proben drei Minuten lang bei 6.000-facher G-Temperatur und Raumtemperatur heruntergeschleudert, um die Zellen mit CD 14 über blaues Inkubieren von 100 Mikrolitern jeder Zellsuspension in 10 Mikrolitern des menschlichen Antikörpers im Verhältnis eins zu 11 in laufendem Puffer für 10 Minuten bei vier Grad Celsius zu inkubieren. Nachdem der ungebundene Antikörper in einem Milliliter Laufpuffer weggewaschen wurde, resuspendieren Sie die Zellen in 200 Mikrolitern frischem Laufpuffer für die durchflusszytometrische Analyse.
Um die spektrale Spillover-Kompensation einzurichten, öffnen Sie als Nächstes das Feld für die Geräteeinstellungen in der Durchflusszytometrie-Software und entnehmen Sie dann eine Antikörper-unmarkierte Nanopartikel-freie Probe mit niedriger Fluidikgeschwindigkeit. Das Anpassen der Kompensationseinstellungen in Gegenwart von fluoreszierenden Nanopartikeln ist der kniffligste Teil des Verfahrens, da die Nanopartikel die Seitenstreuung stören können Um den Erfolg zu gewährleisten, muss ein Gate der interessierenden Zellpopulation definiert werden. Passen Sie die Vorwärts- und Seitenstreuung manuell an, indem Sie die Spannungskanäle regulieren. Zeichnen Sie dann ein entsprechend großes Tor um die gewünschte Zellpopulation.
Laden Sie ein anderes, unbeschriftetes Sample und öffnen Sie die Registerkarte "Kompensation" im Feld "Geräteeinstellungen". Passen Sie den Kompensationsfaktor während der Aufnahme an, bis die Fluoreszenzintensität im Spillover-Kanal für die Fluorochrom-positiven und -negativen Populationen ungefähr gleich ist. Nachdem schließlich die Kompensation für jedes einzelne gefärbte Fluorochrom-Kontrollröhrchen angepasst und die mit Nanopartikeln behandelten Proben abgelesen worden waren, um das Verhalten der weißen Blutkörperchen als Reaktion auf Nanopartikel besser zu charakterisieren, wurden Internalisierungsassays durchgeführt, wie gerade gezeigt.
Zum Beispiel wurden in diesem repräsentativen Experiment drei Haupt-Blutleukozyten-Subpopulationen durch Vorwärts- und Seitenstreuung nach PBMC-Isolierung eindeutig identifiziert. Darüber hinaus zeigten Lymphozyten, Monozyten und Granulozyten nach der Behandlung mit fz-Siliziumdioxid unterschiedliche Internalisierungsraten von Nanopartikeln, was durch ihre Fluoreszenzintensität angezeigt wird. In diesen Bildern ist die Internalisierung von Nanopartikeln in primären CD 14-positiven Monozyten zu sehen, die von pbmc gereinigt wurden.
Diese Scatterplots zeigen CD 14-positive Monozyten in Gegenwart von fitz'schen Siliziumdioxid-Nanopartikeln. Das Histogramm veranschaulicht die Quantifizierung der fitzy positiven Zellen, ausgedrückt als Fluoreszenzintensität. Ähnliche Internalisierungsexperimente wurden mit TP-1-Monozyten durchgeführt, die mit steigenden Konzentrationen von Fitz-Siliziumdioxid-Nanopartikeln behandelt wurden, wobei unbehandelte Zellen als Negativkontrolle dienten.
Die Punktdiagramme veranschaulichen die dosisabhängige Zunahme der Seitenstreuung mit einer unveränderten Vorwärtsstreuung in der TP-Zelllinie nach der Nanopartikelinternalisierung. Die Daten aus diesen Diagrammen deuten darauf hin, dass die Behandlung mit Fitz-Siliziumdioxid-Nanopartikeln eine dosisabhängige Internalisierung in Monozyten induziert, was durch die Erhöhung der intrazellulären Granularität hervorgehoben wird. Um weitere Einblicke in die Wechselwirkungen zwischen Immunzellen und Nanopartikeln zu erhalten, wurden Mikroglia sieben Tage lang in vitro kultiviert und eine Stunde lang mit Nanopartikeln inkubiert. Die Fluoreszenzmikroskopie zeigte eine gemischte primäre Gliazellkultur mit einer großen Anzahl von GFP-negativen nicht-adhärenten Astrozyten und einigen GFP-positiven Zellen.
In diesem repräsentativen Experiment konnten drei gliale Subpopulationen mittels Durchflusszytometrie unterschieden werden, wobei eine einzelne CD 11 B-Antikörper, die CD 11 B färbte, negative GFP-negative Astrozyten und andere Gliazellen, mikrogliale CD 11 B-positive GFP-negative Zellen und eine CD 11 B-positive GFP-positive Subpopulation. Die beiden letztgenannten Subpopulationen sind in der Lage, Nanopartikel mit einem leicht erhöhten Mangel durch die GFP-positive Population zu internalisieren. Die Internalisierung von Nanopartikeln kann durch konfokale Mikroskopie weiter verifiziert werden, wie in diesem Bild mit stäbchendominierten Siliziumdioxid-Nanopartikeln gezeigt wird.
Bei diesem Verfahren ist es wichtig, daran zu denken, die Proben im Dunkeln zu halten, um ein Ausbleichen der Fluoreszenzfarbstoffe zu vermeiden, und die Proben während der Antikörperinkubation bei vier Grad zu halten. Im Anschluss an dieses Verfahren können weitere Methoden wie die konfokale Mikroskopie durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zur intrazellulären Lokalisierung der Nanopartikel zu beantworten.
Übersicht
Diese Studie konzentriert sich auf die Wechselwirkung fluoreszierender Nanopartikel mit primären Immunzellsubpopulationen unter Verwendung der Durchflusszytometrie. Die Methode ermöglicht die Quantifizierung der Aufnahme von Nanopartikeln in verschiedene Immunzellen und liefert Einblicke in ihr Verhalten.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Immunologie
- Nanotechnologie
- Durchflusszytometrie
Hintergrund
- Nanopartikel können verwendet werden, um Wechselwirkungen von Immunzellen zu untersuchen.
- Die Durchflusszytometrie bietet Vorteile gegenüber der Mikroskopie bei der Quantifizierung von Fluoreszenz.
- Das Verständnis der Internalisierung von Nanopartikeln kann therapeutische Strategien unterstützen.
- Unterschiedliche Typen von Immunzellen können unterschiedliche Reaktionen auf Nanopartikel zeigen.
Zweck der Studie
- Die Interaktion von Nanopartikeln mit Unterpopulationen von Immunzellen analysieren.
- Die Internalisierungsraten von Nanopartikeln in verschiedenen Zelltypen quantifizieren.
- Das Verständnis der Immunantworten auf die Behandlung mit Nanopartikeln verbessern.
Verwendete Methoden
- Primäre Immunzellen wurden mit fluoreszierenden Siliziumdioxid-Nanopartikeln behandelt.
- Die Zellen wurden mit spezifischen Antikörpern für die Durchflusszytometrie markiert.
- Die Kompensationseinstellungen wurden angepasst, um Störungen durch die Nanopartikel auszugleichen.
- Internalisierungsassays wurden durchgeführt, um die Aufnahme der Nanopartikel zu bewerten.
Hauptergebnisse
- Unterschiedliche Populationen von Immunzellen zeigten variierende Raten der Nanopartikel-Internalisierung.
- Mittels Durchflusszytometrie ließen sich effektiv verschiedene Zelltypen anhand der Fluoreszenzintensität unterscheiden.
- Die Internalisierung wurde durch zusätzliche mikroskopische Verfahren bestätigt.
- Die Ergebnisse deuteten auf eine dosisabhängige Beziehung bei der Aufnahme von Nanopartikeln durch Monozyten hin.
Schlussfolgerungen
- Die Studie zeigt den Nutzen der Durchflusszytometrie bei der Analyse von Wechselwirkungen zwischen Nanopartikeln und Immunzellen auf.
- Die Ergebnisse tragen zum Verständnis darüber bei, wie Nanopartikel Immunantworten beeinflussen können.
- Zukünftige Forschungsarbeiten könnten therapeutische Anwendungen von Nanopartikeln in der Immunologie untersuchen.
Häufig gestellte Fragen
Aussagekräftige Relevanz für die Industrie
Diese Methode ermöglicht die quantitative Beurteilung der Internalisierung von Nanopartikeln in primären Immunzellsubpopulationen und unterstützt die Zielvalidierung sowie die mechanistische Risikominderung bei der Entwicklung von Nanotherapeutika. Durch die Bereitstellung dosisabhängiger und zelltypspezifischer Aufnahmedaten verbessert sie die Vorhersagegenauigkeit in der frühen Entdeckungsphase und leitet Entscheidungen über die Fortführung oder Einstellung von nanopartikelbasierten Interventionen. Der Ansatz begegnet einer zentralen Herausforderung im Entdeckungsstadium: der Übersetzung von Wechselwirkungen zwischen Nanopartikeln und Zellen in handhabbare, reproduzierbare Kennzahlen zur Priorisierung von Entwicklungsprojekten.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Wissenschaftlicher Wert: Überprüft therapeutische Hypothesen, indem die Aufnahme von Nanopartikeln in verschiedene Immunzellsubpopulationen quantifiziert wird, wodurch geklärt wird, welche Zellpopulationen mit Nanotransportern interagieren.
- Operationaler Wert: Ermöglicht die biologische Risikominderung durch standardisierte, reproduzierbare Messung der Internalisierung anhand von Fluoreszenzintensität und Verschiebungen des seitlich gestreuten Lichts.
- Prädiktiver Wert: Unterstützt die Priorisierung von Wirkstoffkandidaten, indem Zelltypen mit hoher oder niedriger Affinität zu Nanopartikeln identifiziert werden, was die Auswahl geeigneter Zielstrukturen für immunmodulatorische Nanotherapien leitet.
Screening und Assay-Entwicklung
- Assay-Bereitschaft: Bereitet validierte Immunzellsysteme für die nachgeschaltete Untersuchung vor, indem Basisprofile der Wechselwirkungen mit Nanopartikeln etabliert werden.
- Quantitative Ausgabe: Erzeugt Fluoreszenzintensitäts- und SSC-Metriken, die standardisierte und vergleichbare Messwerte über verschiedene Bedingungen und Zeitpunkte hinweg ermöglichen.
- Plattformwiederverwendung: Unterstützt skalierbare Untersuchungsabläufe durch konsistente Gating-, Kompensations- und Antikörpermarkierungsprotokolle, die auf verschiedene Nanopartikelformulierungen anwendbar sind.
Translationale und präklinische Forschung
- Bedeutung für die Krankheitsforschung: Ermöglicht die Übertragung auf primäre Mikroglia aus mutierten Mäusen und damit zielgerichtete Untersuchungen von Nanopartikeln im zentralen Nervensystem an immunologischen Modellen mit Bezug zu Krankheiten.
- Translationale Kohärenz: Verknüpft Durchflusszytometrie-Daten mit der Bestätigung mittels konfokaler Mikroskopie und stärkt so die mechanistische Interpretation für die präklinische Validierung.
- Risikoadjustierte Weiterentwicklung: Unterstützt Entscheidungen über die Weiterentwicklung, indem differenzielle Aufnahmeraten aufgezeigt werden, beispielsweise durch veränderte Nanopartikel-Aufnahme in GFP-positive Mikroglia-Teilpopulationen.
Pipeline- und Workflow-Integration
Die Methode fügt sich in den Entdeckungsprozess von der frühen Target-Bindungs-Screening-Phase bis zur präklinischen mechanistischen Bewertung ein, insbesondere für immunmodulatorische Nanotherapien, bei denen die Interaktionsprofile von Immunzellen entscheidend sind.
- Entdeckungsbiochemie: Unterstützt die Hypothesenprüfung, indem sie die Exposition gegenüber Nanopartikeln mit messbaren Veränderungen der Zellgranularität und Fluoreszenz verknüpft und so die Mechanismen der Aktivierung oder Modulation von Immunzellen aufklärt.
- Screening: Stellt Bereitschaft für Assays sicher durch standardisierte Schritte der Isolierung, Markierung und Kompensation, die eine reproduzierbare Quantifizierung der Wechselwirkungen zwischen Nanopartikeln und Zellen gewährleisten.
- Analytik: Liefert quantitative abhängige Messgrößen (Fluoreszenzintensität, SSC-Verschiebungen), die den Vergleich der Internalisierung zwischen verschiedenen Zelltypen, Konzentrationen und Zeitpunkten ermöglichen.
- Translationale Forschung: Knüpft an die präklinische Validierung an, indem sie mittels orthogonaler Bestätigung durch konfokale Mikroskopie erfolgt und somit mit biomarkerbasierter, mechanistischer Risikominderung übereinstimmt.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Funktioniert als wiederverwendbare Methode für verschiedene Nanopartikelformate (z. B. FITC-SiO₂, Rhodamine-SiO₂) und Immunmodelle (menschliche Blutleukozyten, murine Mikroglia) und reduziert so redundante Methodenentwicklung.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Verringert mechanistische Unschärfen, indem zellulär aufgelöste, quantitative Daten zur Nanopartikel-Internalisierung bereitgestellt werden, wodurch die Zuversicht in immunmodulatorische Strategien erhöht wird.
- Operationaler Wert: Stellt Standardisierung und Reproduzierbarkeit durch definierte Kompensationsprotokolle und Antikörper-Panels sicher und minimiert so die Variabilität zwischen Anwendern und Standorten.
- Strategischer Wert: Verbessert Entscheidungen über Fortführung oder Abbruch, indem frühzeitig identifiziert wird, welche Immunzellsubpopulationen für die Bindung an Nanopartikel anfällig sind, wodurch biologische Risiken in späteren Entwicklungsphasen nanotherapeutischer Wirkstoffe reduziert werden.
- Portfolio-Wirkung: Ermöglicht eine risikoadjustierte Priorisierung, indem Nanopartikelformulierungen hervorgehoben werden, die günstige oder ungünstige Interaktionsprofile mit Immunzellen aufweisen.
Durchführungsüberlegungen
- Erfordert Fachkenntnisse in der Kompensation der Durchflusszytometrie, insbesondere zur Behebung von durch Nanopartikel verursachten Interferenzen im Seitenstreulicht während der Korrektur spektraler Überlappungen.
- Setzt den Zugang zu Durchflusszytometern mit Fluoreszenz- und Streulichtdetektionsfähigkeit sowie Antikörpansetzungen zur Identifizierung von Immunzellsubpopulationen voraus.
- Erfordert eine standardisierte Abstimmung der Gating-Strategien und Kompensationseinstellungen zwischen verschiedenen Arbeitsgruppen, um eine konsistente Dateninterpretation zwischen Entdeckungs- und präklinischen Gruppen sicherzustellen.
- Erfordert bei der Anwendung auf verschiedene Modellsysteme (z. B. adhärente vs. nicht-adhärente Zellen, humane vs. murine Primärzellen) eine Anpassung, um die Zuverlässigkeit des Assays aufrechtzuerhalten.
- Praktische Einschränkung: Fluoreszenz- oder Streueigenschaften von Nanopartikeln können bestimmte Fluorochrome stören, was eine sorgfältige Panelgestaltung und Validierung der Kompensation erfordert, wie im Protokoll beschrieben.
