Affinitätsreinigung des Influenza-Virus Ribonukleoproteinkomplexe aus dem Chromatin der infizierten Zellen

Lyco-Negativstrang-RNA-Viren. Das Genom von Influenzaviren liegt in Form von viralen Ribonukleoprotein-Komplexen vor, oder VRNPs, bei denen die einzelsträngige RNA durch das Nukleoprotein umhüllt und mit dem viralen Polymerase-Komplex assoziiert ist, der aus den Untereinheiten PA, PB1 und PB2 besteht. Um intakte Komplexe aus infizierten Säugetierzellen zu reinigen, werden Hela-Zellen mit einem rekombinanten, Strep-Tag-markierten Influenzavirus inkubiert.

Nachdem das Virus in die Zellen eingedrungen ist, wird die virale RNA im Zellkern nach der Infektion synthetisiert. Die Zellen werden mit einem Detergens lysiert und mithilfe einer auf Zentrifugation basierenden Chromatin-Fraktionierungsprotokoll in zytoplasmatische, nukleäre und Chromatin-Fraktionen aufgeteilt. Anschließend werden die mit Strept-Tag markierten VRPs aus jeder Fraktion affinitätsreinigt. Die Analyse der Protein- und RNA-Zusammensetzung der gereinigten VR-NPS mittels Silberfärbung zeigt, dass selbst eng an Chromatin gebundene VRPs mit diesem Protokoll intakt isoliert werden können. Einer der Hauptvorteile unseres Protokolls im Vergleich zu Standardmethoden zur Affinitätsreinigung von Influenza-Virus-Ribonukleoprotein-Komplexen liegt daher darin, dass mit unserer Methode VR-NPS aus dem Chromatin infizierter Zellen gewonnen werden können, das als Ort der Influenza-Virus-mRNA-Synthese bekannt ist.

Daher könnte unsere Methode verwendet werden, um Fragen zur Regulation der viralen Replikation und Transkription zu beantworten, beispielsweise welche viralen oder zellulären Faktoren, aber auch welche posttranslationalen Modifikationen beispielsweise für die virale mRNA-Synthese oder auch für die Synthese des viralen genomischen RNA erforderlich sind. Forscher, die mit dieser Methode neu sind, könnten daher auf einige Schwierigkeiten stoßen, da die subnukleäre Fraktionierung sehr empfindlich gegenüber biochemischen Bedingungen ist und zudem stark zwischen verschiedenen Zelllinien variieren kann. Beginnen Sie dieses Protokoll mit bebrüteten Zellen, die mit dem Influenzavirus RWSN PB zwei strep infiziert wurden, das einen Strep-Tag genetisch an das C-Terminus des PB-zwei-Untereinheit fusioniert trägt, bei einer Multiplizität der Infektion von drei.

Waschen Sie die Zellen einmal mit kaltem PBS, geben Sie dann 12 Milliliter kaltes PBS hinzu und lösen Sie sie aus der Schale. Mit einem Gummispachtel. Überführen Sie die Zellen in ein 50-Milliliter-Konischglas und pelletieren Sie sie durch Zentrifugation.

Der schwierigste Aspekt dieses Verfahrens ist die Zellfraktionierungsprotokoll. Zellkerne sind sehr empfindlich gegenüber Homogenisierungs- und Mischverfahren, und wenn diese nicht korrekt durchgeführt werden, kann dies einen Chromatin-Extrakt leicht beschädigen. Daher ist es sehr wichtig, nicht nur die Homogenisierungstechniken, sondern auch die allgemeine Handhabung der Lysate, wie hier gezeigt, genau zu befolgen.

Nach dem Abzentrifugieren entfernen Sie das PBS und das Resus und resuspendieren das Zellpellet in 10 Milliliter kaltem Saccharosepuffer. Bringen Sie eine 200-Mikroliter-Pipettenspitze an einer 10-Milliliter-Kunststoffserumpipette an und pipettieren Sie die Zellen damit, um Zellklumpen aufzulösen. Inkubieren Sie die Suspension 10 Minuten lang auf Eis.

Die Zellen gelegentlich vorsichtig umkehren, um sie erneut in Suspension zu bringen. Fügen Sie anschließend Nonidet P-40 auf eine Endkonzentration von 0,5 % hinzu und wirbeln Sie die Probe 15 Sekunden lang bei hoher Geschwindigkeit um. Zentrifugieren Sie danach unverzüglich 10 Minuten bei 3.500 ×g und 4 °C in einer Tischzentrifuge. Entfernen Sie nach der Zentrifugation das Überstand und überführen Sie ihn in ein 15-Milliliter-Konischgefäß.

Bewahren Sie das Überstand bei vier Grad Celsius auf. Dies ist eine zytoplasmatische Fraktion. Das Pellet sollte kleiner und heller als das ursprüngliche Zellpellet sein, wie hier gezeigt.

Wenn das Protokoll zu einem späteren Zeitpunkt abgeschlossen wird, lagern Sie das Zellpellet bei vier Grad Celsius. Andernfalls fahren Sie fort, indem Sie das Pellet mit fünf Millilitern kaltem Saccharosepuffer waschen und wie zuvor zentrifugieren. Sobald die Zentrifugation abgeschlossen ist, entsorgen Sie das Überstand und resuspendieren das Pellet, das die Kerne enthält, in 1,5 Milliliter kaltem Puffer zur nukleoplasmatischen Extraktion.

Überführen Sie das resuspendierte Pellet in einen gekühlten, ausschließlich aus Glas bestehenden vier Milliliter-Dounce-Homogenisator mit passendem Stößel und homogenisieren Sie die Kerne mit 20 Stößen. Dabei sollte nach etwa 10 Stößen ein erhöhter Widerstand spürbar sein; achten Sie darauf, dass keine Schäumung auftritt. Um eine effiziente Homogenisierung zu bestätigen, untersuchen Sie die Probe unter einem Phasenkontrastmikroskop.

Die Kerne sollten nicht länger rund sein, sondern unregelmäßige Formen aufweisen und so aussehen, als wären sie geplatzt. Sobald die Kerne homogenisiert wurden, überführen Sie sie in ein 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen. Inkubieren Sie das Homogenat 20 Minuten lang bei vier Grad Celsius auf einem rotierenden Rädchen.

Anschließend 10 Minuten bei vier Grad Celsius in einer Mikrozentrifuge mit 16.000 × g zentrifugieren. Nach dem Zentrifugieren das Überstand, also die nukleoplasmatische Fraktion, in ein 1,5-Milliliter-Röhrchen überführen und bei vier Grad Celsius lagern. Danach das Pellet in 1,5 Milliliter Puffer zur Verdauung, der auf 37 Grad Celsius vorgewärmt wurde, resuspendieren.

Anschließend die Fraktion 10 Minuten bei 37 Grad Celsius inkubieren. Danach 42 Mikroliter einer fünf Molaren Natriumchloridlösung hinzufügen, um die endgültige Konzentration von Natriumchlorid auf 150 Millimolar einzustellen, und anschließend 20 Minuten auf Eis inkubieren. Zentrifugieren bei 16.000 × g in einer Mikrozentrifuge bei 4 Grad Celsius für 10 Minuten.

Nach dem Zentrifugieren das Überstand entfernen und bei vier Grad Celsius lagern. Dies ist die CH-eins-50-Fraktion. Resuspendieren Sie das Pellet in 1,5 Milliliter kaltem Puffer mit hohem Salzgehalt und inkubieren Sie 20 Minuten auf Eis.

Zentrifugieren Sie bei 16.000 × g in einer Mikrozentrifuge bei vier Grad Celsius für 10 Minuten. Entfernen Sie nach dem Zentrifugieren den Überstand und lagern Sie ihn bei vier Grad Celsius. Dies ist die CH 500-Fraktion.

Nehmen Sie die während des Fraktionierungsprotokolls gesammelten Fraktionen heraus und stellen Sie sie auf Eis. Geben Sie dann der zytoplasmatischen Fraktion 300 Mikroliter fünf molarer Natriumchloridlösung zu. Anschließend überführen Sie je 100 Mikroliter gepackte Strep T in Sphero-Kügelchen pro Fraktion in ein 15-Milliliter-Konischglas.

10 Volumina Streptavidin-Waschpuffer zu den Perlen geben. Das Gefäß umstülpen, um die Probe zu mischen, und fünf Minuten bei 1000 × g in einer Tischzentrifuge zentrifugieren; das Überstand entfernen.

Wiederholen Sie die Pufferwäsche zweimal und resuspendieren Sie das Pellet anschließend in einem gleichen Volumen an Strep-Waschpuffer. Geben Sie 200 Mikroliter gewaschene Streptavidin-Beads in Suspension zu jeder Fraktion hinzu. Inkubieren Sie die Röhrchen eine Stunde lang bei vier Grad Celsius unter Schütteln. Zentrifugieren Sie danach die Röhrchen eine Minute lang bei 1000 × g und vier Grad Celsius und entsorgen Sie den Überstand.

Anschließend einen Milliliter Waschpuffer zu den Pellets hinzufügen, die mit der zytoplasmatischen Fraktion in einem 15-Milliliter-Röhrchen inkubiert wurden. Den Waschpuffer hinzufügen und die Pellets in ein 1,5-Milliliter-Röhrchen überführen. Die Pellets eine Minute lang waschen, dann die Röhrchen eine Minute bei 1000 × g und 4 °C zentrifugieren.

Wiederholen Sie dies zweimal nach dem letzten Waschschritt. Entfernen Sie alle Reste des Waschpuffers mit einer flachen Pipettenspitze. Geben Sie dann 100 µL Elutionspuffer hinzu, mischen Sie vorsichtig und stellen Sie die Röhrchen 15 Minuten lang auf Eis.

Während der Inkubation die Kügelchen gelegentlich durch vorsichtiges Antippen des Röhrchenbodens mischen. Nach 15 Minuten Zentrifugation für eine Minute bei 1000 × g und 4 °C durchführen. Das Senna sammeln, das die eluierten Strep-markierten VRPs enthält.

Wir infizierten unsere Zellen mit dem Influenzavirus-Stamm WSN für neun Stunden, und die fraktionierten Lysate wurden mittels Western Blotting wie hier gezeigt analysiert. Die schonende Isolierung der Kerne ermöglicht eine effiziente Gewinnung zytoplasmatischer Proteine wie Tubulin, verhindert dabei jedoch die Freisetzung reichlich vorhandener nukleärer Proteine. Beachten Sie, dass die mit niedriger Salzkonzentration extrahierte Chromatin-Fraktion an Proteinen angereichert ist, die für die Transkription wichtig sind.

Während die Fraktion mit hohem Salzgehalt hauptsächlich Nukleosomen enthält, um die Proteinzusammensetzung der eluierten zytoplasmatischen Fraktion zu bestimmen, wurden vRNP aus HEK-Zellen, die neun Stunden mit unmarkiertem Virus, RWSN oder RWSN PB2 Strep infiziert wurden, durch Silberfärbung analysiert, wie für ein zytoplasmatisches Eluat gezeigt. Hier zeigt sich ein hohes Verhältnis von NP zu PA, PB1 und PB2, was durch das starke Band oberhalb von 55 Kilodalton im Vergleich zu den Banden zwischen 95 und 100 Kilodalton belegt wird. Dies legt nahe, dass der größte Teil des Strep-PB2 als Bestandteil eines vollständig ausgebildeten vRNP gereinigt wird, mit anderen Worten, nur wenig löslicher Polymerasekomplex wird erfasst. Um die relativen Ausbeuten zu vergleichen, können vRNP nach neunstündiger Infektion mit RWSN PB2 Strep oder RWSN durch Silberfärbung analysiert werden, wie in diesem Silberfärbegel gezeigt. vRNP können nach neunstündiger Infektion aus allen vier zellulären Fraktionen gereinigt werden.

Die höchste Konzentration an vRMPs findet sich im nukleären Plasma, obwohl beträchtliche Mengen auch aus dem Zytoplasma und der Chromatin isoliert werden können. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man hohe Ausbeuten intakter ribonukleoproteinartiger Influenzavirus-Komplexe aus dem Zellkern infizierter Zellen reinigen kann. Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, saubere Puffer zu verwenden und unnötige Exposition der Proben gegenüber Raumtemperatur zu vermeiden, um sowohl den Abbau von RNA und Proteinen als auch die Dissoziation von Protein-Komplexen zu verhindern.

Und vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit einem infektiösen Influenzavirus gefährlich sein kann. Alle Schritte sollten bis zum Hinzufügen von NP-40 zu den Lysaten in einer Sicherheitswerkbank der Biosicherheitsstufe zwei durchgeführt werden.