Isolierung von humanen Nabelschnur-Endothelzellen und ihre Verwendung in der Studie von neutrophilen Transmigration unter Strömungsbedingungen

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, hochwertige humane endotheliale Zellen zu isolieren und sie zur Untersuchung der Mechanismen zu verwenden, die die Neutrophilen-Transmigration unter Durchflussbedingungen regulieren. Dies wird erreicht, indem zunächst humane Nabelvenenendothelzellen isoliert und aufgebracht werden. Der zweite Schritt besteht darin, die Zellen in IBD-Kammern zu überführen.

Anschließend werden frisch isolierte humane Neutrophile über aktivierte endotheliale Zellen perfundiert, wodurch ein Rollen, feste Adhäsion und Transmigration der Neutrophilen erfolgt. Der letzte Schritt besteht in der Quantifizierung der Transmigration mittels Videomikroskopie. Letztendlich können fluoreszenz- und Hellfeldmikroskopie verwendet werden, um die Transmigration von Neutrophilen über aktivierte endotheliale Zellen zu bewerten.

Die Isolierung von Endothelzellen ist einfach zu beschreiben, aber schwer zu erlernen, teilweise weil Schlüsselschritte die Visualisierung der Nabelschnur erfordern. Aus diesem Grund ist die visuelle Demonstration dieser Methode entscheidend. Diese Methode wird uns helfen, zentrale Fragen auf dem Gebiet der Entzündungsforschung besser zu verstehen, beispielsweise wie die Rekrutierung von Leukozyten unter Flussbedingungen abläuft und wie sich Endothelzellen unter Flussbedingungen verhalten.

Obwohl diese Methode Einblicke in die Neutrophilen-Rekrutierung während einer Entzündung ermöglichen kann, lässt sie sich auch auf seltene Leukozytenpopulationen wie natürliche Killerzellen und Eosinophile anwenden. Gemeinsam mit Ritu Sharma demonstriert Hong Jang, eine Technikerin in meinem Labor, dieses Verfahren. Mindestens eine Stunde vor dem Eingriff ein T-75-Fläschchen mit Gelatine vorbehandeln und dann bei 37 °C inkubieren.

Beginnen Sie dann das Verfahren zur Isolierung von Endothelzellen in der laminaren Flusswerkbank, indem Sie mit einer Schere eine Nabelschnur von einer Plazenta abschneiden. Nachdem Sie sterile Handschuhe angezogen haben, untersuchen Sie die Schnur sorgfältig und entsorgen Sie alle Abschnitte, die Blutgerinnsel enthalten oder durch das Abklemmen der Schnur während der Entbindung beschädigt sind. Identifizieren Sie anschließend die beiden Arterien und die einzige Vene, die in der Schnur vorhanden sind.

Danach vorsichtig eine Kanüle mit einem daran befestigten Zwei-Wege-Hahn in eines der Venenenden einführen und anschließend eine Klemme um die Kanüle legen, um sie fest an Ort und Stelle zu halten. Einer der schwierigsten Teile des Verfahrens ist die Perfusion der Nabelschnur. Um sicherzustellen, dass dies erfolgreich durchgeführt wird, die Nabelschnur mit überschüssigem Puffer perfundieren und den Durchfluss beobachten, bis er klar wird.

Spülen Sie die Vene mit Nabelschnurpuffer, bis die Durchflüssung klar ist, und klemmen Sie dann das Ende der Nabelschnur ab. Gelegentlich während der Perfusion wird ein kleines Loch sichtbar, da Ärzte Nabelschnurblut aus der Nabelschnur entnommen haben. In diesen Fällen können Hämostaten verwendet werden, um das Loch zu verschließen, und die Perfusion kann fortgesetzt werden, während Endothelzellen isoliert werden.

Es ist äußerst wichtig, die Kollagenase-Behandlung genau zeitlich zu steuern. Bei zu kurzer Dauer werden nicht genügend endotheliale Zellen gewonnen; bei zu langer Dauer können kontaminierende glatte Muskelzellen auftreten oder Schäden an den endothelialen Zellen entstehen. Anschließend spülen Sie die Vene mit frisch zubereiteter warmer Kollagenaselösung durch.

Schließen Sie den Hahn und inkubieren Sie die Nabelschnur in einem Becher mit warmer Nabelschnurpufferlösung. Entfernen Sie die Nabelschnur nach 10 Minuten und massieren Sie sie vorsichtig, um die endothelialen Zellen aus dem Lumina der Vene zu lösen. Lassen Sie die Lösung in ein Reagenzglas ablaufen, das fünf Milliliter Endothelzellmedium oder ECM enthält, und spülen Sie die Nabelschnur zweimal mit Nabelschnurpuffer, um verbleibende Zellen zu entfernen.

Zentrifugieren Sie die Zellen nun 10 Minuten bei 350 × g. Entfernen Sie bei Raumtemperatur den Überstand und resuspendieren Sie das Zellpellet in 10 Milliliter Endothelzell-Medium. Überführen Sie die Zellen in einen mit Gelatine beschichteten T75-Flasche und kultivieren Sie die Endothelzellen über Nacht bei 37 °C und 5 % CO2. Am nächsten Tag schütteln Sie die Flasche vorsichtig, um verbliebene rote Blutkörperchen zu lösen.

Entfernen Sie dann den Überstand und waschen Sie die Endothelzellkultur mit warmer HBSS. Nach dem Entfernen der HBSS versetzen Sie die Zellen mit 10 Milliliter warmer ECM. Untersuchen Sie anschließend die Zellen unter dem Mikroskop, um sicherzustellen, dass die roten Blutkörperchen entfernt wurden, und bewerten Sie den Grad der Konfluenz sowie die Morphologie der Endothelzellen.

Ersetzen Sie das Medium weiterhin alle drei Tage, bis die Zellen Konfluenz erreichen. Teilen Sie die Zellen zu diesem Zeitpunkt mit einer Trypsin- und EDTA-Lösung. Anschließend sammeln Sie die abgelösten Zellen ein und resuspendieren sie in ECM.

Schließlich jede Vertiefung einer IBD-Kammer mit Gelatine beschichten. Die überschüssige Gelatine entfernen und anschließend 1,5 × 10⁶ der endothelialen Zellsuspension pro Milliliter in jede Vertiefung der Kammer geben. Beginnen Sie mit der Induktion der Hochregulation der Oberflächenexpression von Adhäsions- und Aktivierungsmolekülen, indem Sie die endothelialen Zellen während ihrer Aktivierung mit einem geeigneten Stimulans inkubieren.

Isolieren Sie Neutrophile aus dem peripheren Blut gesunder menschlicher Probanden durch Dichtezentrifugation gemäß zuvor veröffentlichter Methoden und suspendieren Sie die Zellen anschließend in HBSS mit menschlichem Albumin bei einer Konzentration von 1 × 10⁶ pro Milliliter. Richten Sie nach dem Aufbau des Mikroskops die IBD-Kammer, die die stimulierten endothelialen Zellen enthält, an der Tubing des Mikroskops ein. Wählen Sie das 10×-Phasenkontrastobjektiv aus und stellen Sie die Spritzenpumpe so ein, dass sie HBSS unter dem gewünschten Scherstress ansaugt und den Fluss initiiert.

Stoppen Sie den Durchfluss kurz, indem Sie den Dreiwege-Hahn an der Auslassseite in die Aus-Position drehen und die Zuleitung von HBSS auf isolierte Neutrophile umschalten. Setzen Sie den Durchfluss fort, indem Sie den Hahn wieder in die Ein-Position drehen. Beginnen Sie anschließend mit der Aufnahme mittels einer an einen DVD-Recorder angeschlossenen CCD-Kamera.

Starten Sie die Stoppuhr. Wenn nach vier Minuten Neutrophile in die Kammer eintreten, wechseln Sie zurück zu HBSS, um die Anheftung neuer Neutrophiler zu verhindern. Falls Daten zu gesamten Wechselwirkungen, Wälzen und fester Adhäsion gewünscht sind, verwenden Sie einen 10x-Phasenkontrast.

Ziel ist es, zwischen der vierten und fünften Minute sechs zufällige Felder jeweils 10 Sekunden lang abzubilden. Schließlich wechseln Sie zu einem 40x-Objektiv und nehmen ein einzelnes Sichtfeld zum gewünschten Zeitpunkt auf. Nach der Neutrophilen-Perfusion nach 10 Minuten sammeln Sie zwischen fünf und zehn zufälligen Sichtfeldern.

Unstimulierte Endothelzellen unterstützen keine Rekrutierung von Neutrophilen. Daher zeigen die folgenden Abbildungen Neutrophile, die mit TNF-alpha-stimulierten Endothelzellen interagieren. Beachten Sie das adhärierte Neutrophile, wie durch den gelben Pfeil gekennzeichnet, und das transmigrierende Neutrophile, wie durch den weißen Pfeil angegeben.

Die Neutrophilen-Transmigration kann an Zelljunctionen oder durch die Endothelzellen selbst hindurch erfolgen. Um zwischen diesen beiden Bedingungen zu unterscheiden, wurden die Endothelzellen mit einem anti-VE-Kohärenz-Antikörper markiert. Wie hier in Rot dargestellt, wird die Transmigration als parazellulär oder transzellulär eingestuft.

In diesem Modell erfolgt nahezu sämtliche Transmigration parazellulär, wie durch diese Abbildung gezeigt wird, die eine Überlagerung der beiden vorherigen Abbildungen darstellt. In diesem ersten von drei Diagrammen wurden Neutrophilen-Interaktionen mithilfe der Bildanalyse-Software Image J untersucht und quantifiziert. Beachten Sie, dass signifikant mehr Interaktionen zwischen Neutrophilen und TNF-alpha-aktivierten Endothelzellen stattfanden als zwischen Neutrophilen und kontrollierten, nicht stimulierten Endothelzellen.

Die gesamten interagierenden Zellen wurden wie zuvor als rollende oder festhaftende bzw. transmigrierende Zellen charakterisiert. Signifikant mehr Neutrophilen-Transmigration trat in den Mulden mit aktivierten Endothelzellen auf, nachdem die Endothelzellen isoliert worden waren. Weitere Methoden wie Western Blotting, Echtzeit-PCR und die Messung des endothelialen Widerstands können durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zur Endothelzellbiologie nach der Entwicklung zu beantworten.

Diese Methode wird Forschern auf den Gebieten Entzündung und Gefäßbiologie helfen zu verstehen, wie die Rekrutierung von Leukozyten unter Flussbedingungen in einem humanen Modellsystem abläuft. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man humane endotheliale Nabelvenen-Zellen isoliert und sie zur Untersuchung der Neutrophilen-Transmigration unter Flussbedingungen unter Verwendung einer ity-Kammer nutzt.