Einzel Oocyte Bisulfit-Mutagenese

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, die DNA-Methylierung in einer einzelnen Oozyte zu analysieren. Dies wird zunächst erreicht, indem die Cumuluszellen und die Seifenpalita von den gesammelten Oozyten entfernt werden. Der zweite Schritt besteht darin, die Oozyte in einer zwei zu eins-Aros-Lysepufferlösung einzubetten, um die geringe Menge an DNA vor Verlust oder Abbau zu schützen.

Anschließend wird eine Bisulfit-Mutagenese durchgeführt, gefolgt von einer Amplifikation mittels nested Polymerase-Kettenreaktion. Der letzte Schritt besteht darin, das PCR-Produkt zu ligieren und zu klonen. Anschließend werden Klone ausgewählt, per PCR amplifiziert und zur Sequenzierung versandt.

Schließlich wird die Bisulfit-Mutagenese in Kombination mit Sequenzierung verwendet, um die DNA-Methylierung an Cytosin-Phosphat-Guanin- oder CPG-Dinukleotiden eines Bereichs von Interesse in einer einzelnen Oozyte nachzuweisen. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie der Bisulfit-Mutagenese mit großen Zellzahlen besteht darin, dass Daten aus einer einzelnen Oozyte gewonnen werden können, ohne dass eine Pooling-bedingte PCR-Verzerrung oder eine Kontamination durch somatische Zellen auftritt. Am Tag der Oozytengewinnung sollten frisch die im schriftlichen Protokoll aufgeführten Lösungen hergestellt werden; um die Wahrscheinlichkeit einer DNA-Kontamination zu verringern, sollten häufig die Handschuhe gewechselt und Filterpipettenspitzen verwendet werden. Außerdem sollten die Röhrchen beim Öffnen stets schräg gehalten und alle Röhrchen, wenn sie nicht benutzt werden, sofort wieder verschlossen werden.

Beginnen Sie die OSI-Sammlung, indem Sie die dissezierten Maus-Ovidukte in M2-Medien geben und den M-Pulley zerreißen, um den Cumulus-Zellkomplex zu isolieren. Anschließend werden die Zellen mittels einer Lösung mit 0,3 Milligramm pro Milliliter Hyaluronidase in einem Tropfen von 30 Mikroliter M2-Medien vom Cumulus-Zellkomplex getrennt. Die Zellen sollten nur so lange in der Lösung verbleiben, wie es zum Entfernen der Cumuluszellen benötigt wird, da eine längere Einwirkung Schäden verursachen könnte.

Spülen Sie die Oozyten durch Übertragung von Tropf zu Tropf in 30-Mikroliter-Tropfen M2-Medium. Entfernen Sie dabei regelmäßig die Cumuluszellen, insgesamt drei Spülgänge. Entfernen Sie die Zona pellucida mittels saurer Tyrode-Lösung.

Legen Sie die Oozyten zuerst in einen Tropfen mit 30 Mikroliter Lösung und überführen Sie sie anschließend in einen weiteren Tropfen von 30 Mikrolitern. Jedes mitgeführte Medium würde die Säure verdünnen und ihre Wirksamkeit verringern. Belassen Sie die Zellen nur so lange in der Lösung, wie es zum Entfernen der Zona erforderlich ist, da eine längere Exposition sie beschädigen könnte.

Nach dem Entfernen der Zona die Zellen erneut in einem Tropfen von 30 Mikrolitern M2-Medium waschen, um die Agarose-Einbettung durchzuführen. Stellen Sie zunächst die Lysepufferlösung auf einen 70 °C heißen Wärmeprobe. Geben Sie die vorgewärmte Niedrigschmelzpunkt-Agarose (LMP-Agarose) zur Lysepufferlösung hinzu, wodurch ein Verhältnis von zwei Teilen Agarose zu einem Teil Lysepuffer entsteht. Anschließend eine einzelne Oozyte in minimalem M2-Medium auf einen sauberen Objektträger geben.

Der nächste Schritt besteht darin, die einzelne Zelle in die Agarose-Lyse-Lösung einzubetten. Dies muss schnell erfolgen, da die Agarose bei Temperaturen unter 65 Grad Celsius aushärtet. Pipettieren Sie unter dem Mikroskop 10 Mikroliter der Agarose-Lyse-Lösung in eine Pipettenspitze.

Geben Sie vorsichtig etwa ein Mikroliter oder weniger der Agros-Lyse-Lösung auf den Objektträger, sodass sie sich mit dem minimalen Medium vermischt. Saugen Sie dann das Oozyte vorsichtig in die Pipettenspitze auf. Geben Sie danach das gesamte Volumen von 10 Mikrolitern in ein Eppendorf-Röhrchen mit 300 Mikrolitern Mineralspiritus, sodass die resultierende Tröpfchen eine kugelförmige Gestalt annimmt.

Den Behälter 10 Minuten lang auf Eis inkubieren, um die Lyse durchzuführen. Entfernen Sie 300 Mikroliter Mineralsöl und geben Sie 500 Mikroliter Puffer mit SDS-Lysepuffer hinzu. Inkubieren Sie die Probe am zweiten Tag über Nacht in einem Wasserbad, das auf 50 Grad Celsius eingestellt ist.

Bereiten Sie die Bifulfid-Mutageneselösungen frisch gemäß der schriftlichen Anleitung vor. Beginnen Sie die Mutagenese, indem Sie vollständig 500 Mikroliter SDS-Lysepuffer entfernen. Beachten Sie, dass verbleibender Lysepuffer das Agros verdünnt, wenn es erhitzt wird, und die Perle in den nachfolgenden Schritten anfälliger für das Auflösen ist.

Nach vollständiger Entfernung des Lysepuffers 300 Mikroliter Mineralöl hinzufügen. Die Probe 2,5 Minuten lang auf einem 90 °C heißen Block inkubieren. Darauf achten, dass keine Vermischung, Rührung, Verlängerung oder Temperaturschwankung erfolgt.

Nach zweieinhalb Minuten inkubieren Sie die Probe 10 Minuten lang auf Eis. Zum Durchführen der Denaturierung entfernen Sie das Paraffinöl und geben ein Milliliter 0,1-molare Natriumhydroxidlösung zu dem Gefäß hinzu; schwenken und drehen Sie das Gefäß fünf bis sechs Mal um.

Inkubieren Sie die Probe 15 Minuten lang in einem Wasserbad, das auf 37 Grad Celsius eingestellt ist, und drehen Sie das Gefäß alle drei bis vier Minuten um. Die Perle sollte im Natriumhydroxid schwimmen. Beachten Sie, dass sich die Perle nicht mehr am Boden des Reaktionsgefäßes befindet.

Um die Sulfittierung durchzuführen, zentrifugieren Sie das Gefäß vorsichtig, nachdem Sie das Natriumhydroxid entfernt haben. Geben Sie 300 Mikroliter Mineralöl und 500 Mikroliter BIS-Sulfitlösung hinzu. Achten Sie darauf, eine Belichtung mit Licht zu vermeiden, und inkubieren Sie das Gefäß dreiinhalb Stunden lang in einem 50 Grad Celsius warmen Wasserbad.

Führen Sie nun die Desamination durch. Inkubieren Sie die Probe zuerst drei Minuten lang auf Eis, bevor Sie das Mineralsilikon und die BIS-Sulfitlösung entfernen. Nach einem vorsichtigen Schwenken geben Sie ein Milliliter 0,3-molare Natriumhydroxidlösung hinzu und schwenken das Gefäß fünf bis sechs Mal um.

Die Probe 15 Minuten lang inkubieren. In einem Wasserbad mit 37 Grad Celsius alle drei bis vier Minuten umdrehen; erneut sollte die Kugel vor Beginn der PCR im Natriumhydroxid schwimmen. Die Proben waschen, indem sie zuerst vorsichtig zentrifugiert werden.

Entfernen Sie dann die Natronlauge und geben Sie ein Milliliter 1xTE, pH 7,5, hinzu. Schütteln Sie fünf bis zehn Minuten bei Raumtemperatur. Nach einem zweiten vorsichtigen Zentrifugationsschritt entfernen Sie das 1xTE.

Wiederholen Sie diesen Waschvorgang zweimal. Anschließend ein Milliliter autoklaviertes, doppelt destilliertes Wasser hinzufügen. Fünf bis zehn Minuten bei Raumtemperatur schütteln, sanft zum dritten Mal abzentrifugieren und das Wasser entfernen.

Wiederholen Sie die Spülung mit doppelt destilliertem Wasser zweimal. Entfernen Sie abschließend sämtlichen Überstand, sodass nur noch die Aros-Perle zurückbleibt. Überprüfen Sie, ob der pH-Wert des Überstandes 5,0 beträgt.

Falls das Überstand noch zu basisch ist, waschen Sie die Kügelchen erneut mit doppelt destilliertem Wasser. In der Zwischenzeit fügen Sie die PCR-Mischung der ersten Runde dem PCR-Gefäß gemäß der schriftlichen Anleitung hinzu. Bewegen Sie den festen Agro-Speed an den Rand des Einor-Gefäßes.

Überführen Sie die Agro-Suspension dann vorsichtig in ein PCR-Röhrchen, erhitzen Sie sie eine Minute lang auf 70 Grad Celsius und mischen Sie sie anschließend; die Amplifikation wird gemäß des schriftlichen Protokolls durchgeführt. Bereiten Sie nach der ersten Amplifikationsrunde die PCR-Reaktion der zweiten Runde unter Verwendung von fünf Mikrolitern des Produkts der ersten Runde als Vorlage vor. Achten Sie darauf, unterhalb der Mineralschichtöl-Schicht zu pipettieren.

Führen Sie die zweite Amplifikationsrunde wie im Text beschrieben als diagnostischen Test durch. Die Proben der zweiten Runde können mit einem restriktionsenzymatisch geschnitten werden, das methylierungs- oder stammspezifisch ist, und die Verdauungsprodukte werden mittels Elektrophorese auf einem 8 %igen Acrylamidgel analysiert. Heterogene Banden weisen auf mehr als eine Sequenz hin; klonen Sie das Produkt der zweiten Runde, indem Sie es in den Vektor ligieren, und führen Sie einen TA-Kloning gemäß der Beschreibung in der der vorliegenden Videoaufnahme beigefügten Publikation durch. Nach dem TA-Kloning wird die gesamte Reaktionsmischung auf eine Agar- und LB-Platte, ergänzt mit Ampicillin, X-Gal und IPTG, aufgebracht und die Platte über Nacht bei 37 Grad Celsius inkubiert.

Fügen Sie dann die Colony-PCR-Master-Mix-Lösung dem PCR-Röhrchen gemäß dem schriftlichen Protokoll hinzu. Wählen Sie eine weiße bakterielle Kolonie von der Platte mit einer Pipettenspitze aus und wirbeln Sie sie in 35 Mikroliter der Colony-PCR-Master-Mix-Lösung in einem PCR-Röhrchen auf. Fahren Sie fort, indem Sie die Suspension wie im Text beschrieben amplifizieren, und trennen Sie vier Mikroliter des PCR-Produkts mittels Elektrophorese an einem 1,5 %igen Agarosegel auf.

Senden Sie abschließend etwa 30 Mikroliter des PCR-Produkts zur Sequenzierung von fünf Kolonie-PCR-Ansätzen pro Zelle. Sobald die Sequenzierungsresultate vorliegen, können die Methylierungsmuster analysiert werden: Jedes ursprüngliche Cytosin-Guanin, das als solches erhalten blieb, war methyliert. Umgekehrt war jedes ursprüngliche Cytosin-Guanin, das nun als Thymin-Guanin vorliegt, nach der nested PCR-Amplifikation unter Verwendung von Bisulfit-konvertierten Primern nicht methyliert.

Es ist möglich, eine erfolgreiche Umwandlung zu bestätigen, indem eine korrekte Fragmentgröße auf einem Aros-Gel einzelner Metaphasen visualisiert wird. Zwei Oozyten repräsentieren ein elterliches Allel und weisen theoretisch ein geprägtes Methylierungsmuster auf. Solche PCR-Produkte der zweiten Runde können auf unbeabsichtigte Kontaminationen getestet werden.

Ein Restriktionsenzym, das empfindlich gegenüber DNA-Methylierung ist, kann verwendet werden, um das PCR-Produkt der zweiten Runde zu verdauen, um zu bestimmen, ob es ein methyliertes oder unmethyliertes Allel enthält. Hierbei wird eine methylierte Cytosinbase innerhalb der Erkennungssequenz des Enzyms gespalten. Ein unmethyliertes Cytosin hingegen, das in Thymin umgewandelt wurde, wird vom Enzym nicht mehr erkannt und bleibt ungeschnitten. Jede Metaphase-Zwei-Oozyt-Probe, die sowohl methylierte als auch unmethylierte Allele enthält, sollte verworfen werden, da dies auf eine Kontamination mit Cumuluszellen oder den Einbezug eines Polkörperchens hinweist, nach Ligation und Transformation.

Eine erfolgreiche Kolonie-PCR-Amplifikation kann auf einem AROS-Gel sichtbar gemacht werden, um sicherzustellen, dass Proben mit der korrekten Produktgröße zur Sequenzierung geschickt werden. Für dieses Beispiel beträgt die erwartete Amplikonlänge nach Ligierung hundertsechsundfünfzig Basenpaare. Hier weist Klon fünf eine falsche Amplikonlänge auf und sollte nicht zur Sequenzierung geschickt werden.

Die Sequenz von fünf einzelnen Klonen aus einer Metaphase-zwei-Oozyte sollte fünf identische Methylierungsmuster und identische Nicht-CPG-Umwandlungsraten ergeben. Jegliche Proben, die mehr als ein Muster enthalten, sollten verworfen werden. Da ovulierte Metaphase-zwei-Zyten zwei Chromosomenkopien oder einen angehängten Polkörper enthalten, besteht die Möglichkeit, zwei ähnliche Sequenzmuster zu erhalten.

Daten sollten von Zellen verworfen werden, die stark voneinander abweichende Methylierungsmuster aufweisen. Da eine Kontamination mit Cumuluszellen nicht ausgeschlossen werden kann, ist es wichtig, beim Durchführen dieses Verfahrens zunächst die Oozyten mehrfach in frischem Medium zu waschen, nach der HI-IDE-Behandlung, um so viele Cumuluszellen wie möglich zu entfernen. Zweitens verfestigt sich Agarose mit niedrigem Schmelzpunkt bei Temperaturen unterhalb von 65 Grad Celsius, daher sollte sorgfältig, aber zügig gearbeitet werden.

Und schließlich sind Natriumbisulfat und Hydrochinon lichtempfindlich, daher sollten Reaktionsgefäße und Lösungen mit Aluminiumfolie umwickelt werden.