Optische Aufnahme überschwellige neuronale Aktivität mit Single-Cell-und Single-Spike Auflösung

Das übergeordnete Ziel des FollowMe-Experiments besteht darin, die Aktivität von Spikes aus einer großen Anzahl von Neuronen zu registrieren. Dies wird erreicht, indem im ersten Schritt mittels Fluoreszenzmikroskopie der Anstieg der intrazellulären Kalziumkonzentration im Soma eines Neurons, der mit jedem Aktionspotential assoziiert ist, beobachtet wird. Mithilfe der Zwei-Photonen-Anregung und eines Scanning-Prinzips mit zufälligem Zugriff werden Kalzium-Fluoreszenzsignale von 40 Neuronensomen mit hoher räumlicher und zeitlicher Auflösung aufgezeichnet.

Im zweiten Schritt werden die präzisen Spiketimes aus den fluoreszenten Signalen mithilfe eines Entfaltungsalgorithmus extrahiert. Diese Technik kann verwendet werden, um Spikaktivitäten von mehreren Dutzend Neuronen aufzuzeichnen. Die Spikdaten können anschließend genutzt werden, um die gegenseitige Information, die Signalweiterleitung zwischen neuronalen Populationen oder neuronale Korrelationen zu messen.

Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie der Mikroelektrodenableitung besteht darin, dass man die Aktivität einer großen Anzahl von Neuronen aus einer lokalen Population gleichzeitig aufzeichnen kann. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen zur kortikalen Funktion auf der Ebene lokaler neuronaler Netzwerke zu beantworten, beispielsweise zur Bedeutung von Informationskorrelationen und zu Veränderungen in der Netzwerkdynamik im Zusammenhang mit kortikaler Plastizität. Für die Zwei-Photonen-Anregung wird ein Infrarot-Puls-Lasersystem mit Femtosekunden-Pulsen verwendet. Eine hohe Laserleistung ist erforderlich, um die erheblichen Verluste auszugleichen, die durch die optischen Komponenten des Systems verursacht werden.

Ein Vorläufer pro System, bestehend aus zwei Prismen, verleiht den Laserpulsen vor den optischen Ablenkern eine negative Gruppengeschwindigkeitsdispersion, um die zeitliche Dispersion, die durch die AODs verursacht wird, auszugleichen. Zwei AODs mit großen Blenden lenken den Laserstrahl in zwei Dimensionen ab. Ein reflektives Beugungsgitter mit 100 Linien pro Millimeter wird 13 Zentimeter hinter den AODs platziert, um die räumliche Dispersion auszugleichen, die durch die AODs verursacht wird. Bei Verwendung kurzer Laserpulse wird der Laserstrahl mit zwei Relais-Teleskopen in den Kameraport eines aufrechten Mikroskops gelenkt.

Irissblenden werden in regelmäßigen Abständen zur Ausrichtung der optischen Komponenten platziert. Ein dichroitischer Strahlteiler vor dem Objektiv leitet das Infrarot-Anregungslicht zur Probe weiter und reflektiert das Fluoreszenzlicht der Probe auf einen Detektor. Epi- und Trans-Fluoreszenzdetektoren sammeln das Fluoreszenzsignal über das Objektiv, und farbige Glasfilter werden vor den Detektoren angebracht, um zu verhindern, dass Anregungslicht die Detektoren erreicht.

Die A-OD-Ablenkwinkel werden von einem Computer gesteuert, der mit einer digitalen Analog-Umsetzerkarte ausgestattet ist und wiederum spannungsgesteuerte Oszillatoren ansteuert. Das Signal von den Photoverstärkern wird über einen Tiefpass-Butterworth-Filter mit einer Grenzfrequenz von 100 Kilohertz geleitet und anschließend mit einer Taktrate von 156,25 Kilohertz durch einen Analog-Digital-Umsetzer digitalisiert, bevor es zur Analyse auf einem Computer gespeichert wird. Ausrichtung und elektrisches Rauschen werden getestet, indem die Verteilung der Fluoreszenzsignale mit und ohne Laserlicht bei niedriger und hoher Verstärkung der Photoverstärker sowie mit und ohne Indikator aufgezeichnet wird. Zufallsadressierbares Abtasten basiert auf der Detektion intrazellulärer Anstiege von Calcium. Der erste Schritt des Protokolls besteht darin, eine große Anzahl von Neuronen durch Bolus-Injektion mit der Esther-Form eines Calcium-Indikators zu färben.

Als Nächstes erfassen Sie die Aktivität des Soma an jedem Neuron an vier Stellen für jeweils 6,4 Mikrosekunden an jeder Stelle. Um die Neuronen von Interesse auszuwählen, nehmen Sie einen Vollbildrahmen mit 256 mal 256 Pixeln auf. Wählen Sie dann manuell die Zentren der Neuronen innerhalb dieses Bildes aus, die aufgezeichnet werden sollen.

Drei Punkte in einem Abstand von zwei Mikrometern um jedes Zentrum werden in jedem Zyklus automatisch durch die Steuersoftware hinzugefügt. Das fluoreszierende Signal wird von den vier Positionen in allen 40 Neuronen aufgezeichnet. Die Aufzeichnung von allen Neuronen in einem Zyklus benötigt 1,536 Millisekunden.

Wiederholen Sie diese sequenzielle Aufnahme aller 40 Neuronen für fünf Sekunden. Die Spikenerkennung aus fluoreszierenden somatischen Kalziumsignalen beruht auf einem hohen Signal-Rausch-Verhältnis. Ein hohes Signal-Rausch-Verhältnis kann durch Erhöhung der Anregungsintensität erreicht werden.

Jedoch kann die Anregungsintensität aufgrund von Photodamage nur bis zu einer bestimmten Grenze erhöht werden. Es gibt nur ein sehr kleines Fenster der Anregungsintensität, in dem die Photodamage gering ist und das Signal-Rausch-Verhältnis ausreicht, um einzelne Spikes zu detektieren, um sicherzustellen, dass die aufgezeichneten Signale innerhalb des Fensters mit hoher Spikedetektion liegen. Während eines Experiments werden mehrere von unserem Labor entwickelte Software-Tools für die Online-Analyse verwendet.

Berechnen Sie anschließend die ungefähre Photonenzahl pro Neuron aus einem kurzen Zeitfenster des Basisrauschens von etwa 100 bis 200 Millisekunden. Die Anzahl der Photonen und die Photonenzahlrate werden aus den Fluoreszenzwerten berechnet, indem die Verteilung der relativen Fluoreszenzänderungen mit dieser Gleichung angepasst wird. Danach berechnen Sie die Basislinien-Fluoreszenz aus dem gleichen Zeitfenster und tragen sie als Funktion der Zeit oder der Versuche auf. Halten Sie den durchschnittlichen Abfall der Basislinie durch Anpassung der Laserleistung unter 0,0002 pro Sekunde.

Da die Spikenerkennung rapide abnimmt, wenn dieser Grenzwert überschritten wird. Überprüfen Sie danach alle 10 bis 20 Minuten die somatischen Positionen der Neurone, indem Sie ein Vollbild aufnehmen. Passen Sie die Aufnahmestellen bei Bedarf an.

Die fluoreszenten Signale, die sich aus der neuronalen Aktivität ergeben, verzögern sich oft zeitlich aufgrund des langen Abklingens des Kalziumtransienten. In diesem Verfahren wird eine Dekonvolutionsmethode verwendet, um Spikes und Spiketimepunkte aus den fluoreszenten Signalen zu extrahieren. Hier verwenden wir einen genetischen Algorithmus, um das wahrscheinlichste Spiketrain-Modell zu bestimmen, das zum aufgezeichneten fluoreszenten Signal passt.

Bei jeder Iteration des Algorithmus nähert sich die maximale Wahrscheinlichkeit asymptotisch ihrem Maximum an, das durch das Rauschen der Fluoreszenzaufzeichnungen gegeben ist. In inhomogenen neuronalen Populationen kann das durch einen Spike ausgelöste Kalziumsignal zwischen einzelnen Neuronen variieren. Für die unbeaufsichtigte Analyse großer Datensätze haben wir einen Algorithmus entwickelt, der die Variation des spikeausgelösten Kalziumsignals von Neuron zu Neuron berücksichtigt, um eine hohe Anzahl falsch positiver Detektionen zu vermeiden.

Die gemeinsame Verteilung der Amplitude und der Abklingzeitkonstante einzelner Aktionspotentiale hervorgerufener Kalziumtransienten wird in einer separaten Versuchsreihe an demselben Neuronentyp unter identischen experimentellen Bedingungen aufgezeichnet. Um langsame Basislinienänderungen zu berücksichtigen und die Rechenkosten der Dekonvolution zu reduzieren, werden längere Aufzeichnungen für jedes Neuron in jeder Aufnahme in mehrere kürzere Spuren von ein bis fünf Sekunden unterteilt. Der Dekonvolutionsalgorithmus prüft dabei eine große Anzahl von Modellen – bis zu einer Million oder mehr. Um die Dekonvolution zu beschleunigen, wird ein Experiment parallel auf bis zu 10 verschiedenen Computern dekonvolviert.

Nach der Dekonvolution werden die Spikedaten analysiert und überprüft. Die Wahrscheinlichkeit der Spikes im peri-stimulus Zeit-Histogramm sowie die Feuerrate der Neuronen werden automatisch berechnet. Hier sind Beispiele für ein fluoreszierendes Signal, das mit einer sehr niedrigen Anregungsrate und ein weiteres mit einer sehr hohen Anregungsrate innerhalb des Detektionsfensters aufgezeichnet wurde.

Beachten Sie, dass jedes Beispiel die Antwort auf einen einzelnen Aktionspotentialausbruch zeigt. Hier ist ein Foto-Mikrograf einer akuten Gehirnschnitts und zwei Stimulationspipetten, die in derselben kortikalen Säule platziert sind. In Schicht vier zeigen diese die neuronalen Antworten auf wiederholte Reize, und dieser Graph veranschaulicht die von der aufgezeichneten Neuronenpopulation übertragene Shannon’sche gegenseitige Information.

Hier ist die Messung der Ausbreitung suprathresholder Spikaktivität zwischen verschiedenen Populationen kortikaler Neuronen. Dies sind die detektierten Spikes in kortikalen Neuronen als Antwort auf elektrische Stimulation thalamokortikaler Fasern. Bei der Aufzeichnung neuronaler Aktivität mittels zufälligem Zugriffsscanning ist es sehr wichtig, innerhalb des Detektionsfensters aufzuzeichnen.

Andernfalls ist es sehr leicht, mit unbrauchbaren Datensätzen zu enden. Die optische Spikenerkennung steckt noch in den Kinderschuhen. Es besteht noch viel Verbesserungspotenzial.

Mit einigen Verbesserungen nehmen wir von noch mehr Neuronen Aufzeichnungen vor. Mit weiteren Verbesserungen werden wir sogar in wachen und verhaltensaktiven Tieren aufzeichnen können.