Single Cell Messung der Freisetzung von Dopamin mit gleichzeitiger Voltage-Clamp-und Amperometry
21. November 2012
Der amperometrische Technik misst Dopamin-Freisetzung aus einer einzelnen Zelle durch Detektieren der aktuellen durch spontane oxidative Dopamin Oxidation produziert. Gleichzeitige Voltage-Clamp und Amperometrie Methodik zeigen die mechanistische Beziehung zwischen der Gesamt-Wertung "Aktivität" Dopamin-Transporter und die regulatorische Rolle dieser Aktivität auf den Rücktransport von Dopamin.
Das Ziel dieses Verfahrens besteht darin, den umgekehrten Transport von Dopamin in einem Neuron zu messen, das mittels simultaner Patch-Clamp- und Pyrometrie-Methode unter Spannungsfixierung steht, um die von DAT vermittelte Dopaminfreisetzung zu quantifizieren. Dies wird erreicht, indem zunächst die Integrität der pyrometrischen Elektrode mit Dopamin überprüft wird. Im zweiten Schritt wird die pyrometrische Elektrode nahe der Zelle positioniert und mittels einer Patch-Pipette ein Ganzzell-Patch des Neurons hergestellt.
Anschließend wird die Zellspannung mittels der Patch-Pipette gesteuert, und die von der Zelle über den Dopamintransporter (DAT) freigesetzte Dopaminmenge wird gleichzeitig mit einer pyrometrischen Elektrode aufgezeichnet. Im letzten Schritt wird der DAT-Blocker hinzugefügt, und die Ganzzell- sowie die Pyrometrie-Ströme werden erneut registriert, um den spezifisch durch den Dopamintransporter vermittelten Strom durch Subtraktion zu ermitteln. Die Bedeutung dieser Methode liegt in der Möglichkeit, den umgekehrten Transport von Dopamin über den Dopamintransporter zu messen, während gleichzeitig die Spannung des dopaminergen Neurons kontrolliert wird.
Das gleichzeitige Patch-Clamp- und Barometrie-Aufzeichnungssystem erfordert ein umgekehrtes Mikroskop mit hervorragender DIC-Optik und einem Objektiv mit großer Arbeitsdistanz, um eine Gleichlichtquelle für das System zu erzeugen. Um eine geringe elektrische Rauschentwicklung zu erreichen, wird das Mikroskop-Lichtsystem an eine Autobatterie angeschlossen. Hydraulische Mikromanipulatoren werden verwendet, da sie in unserer Konfiguration nicht wesentlich zu den Rauschpegeln beitragen.
Ein rechtshändiger Manipulator wird für die Spannungsfixierung und die Ganzzellableitung verwendet, der linkshändige Manipulator für die Pyrometrie. Um die Elektrode für die Ganzzellableitung vorzubereiten, ziehen Sie eine Quarzpipette mit einem P 2000-Ziehgerät. Üblicherweise verwenden wir eine Pipette mit einem Widerstand von drei bis vier Megaohm.
Füllen Sie als Nächstes die Elektrode mit der Pipettierlösung, die ein Millimolar Dopamin enthält. Befestigen Sie sie dann am Pipettenhalter am rechten Manipulator. Achten Sie darauf, das Gefäß, das die Dopamin enthaltende Pipettierlösung aufnimmt, mit Aluminiumfolie abzudecken und bei Nichtgebrauch auf Eis zu lagern.
Da Dopamin oxidierbar ist, verringert das Aufbewahren der Lösung auf Eis und der Schutz vor Licht die Oxidationsrate. Fädeln Sie den Silberdraht in den Elektrodenhalter ein und schrauben Sie anschließend den am-Parametrischen Adapter auf den Elektrodenhalter. Füllen Sie danach die Dreielektrode mit ausreichend Quecksilber, um den Silberdraht zu kontaktieren.
Wenn die Elektrode am Adapter befestigt ist, überprüfen Sie unter dem Mikroskop sorgfältig die pro CFE-geräuscharme Kohlenstofffaser und die parametrische Elektrode, um sicherzustellen, dass die Spitze sauber und unbeschädigt ist. Achten Sie darauf, das ferne Ende der Kohlenstofffaser festzuhalten, um die Spitze der Kohlenstofffaser vor Beschädigungen zu schützen. Danach befestigen Sie die pro CFE Tric-Elektrode.
Montieren Sie anschließend die zusammengesetzte Elektrode am linken hydraulischen Manipulator, um die Integrität der Tric-Elektrode zu überprüfen. Senken Sie sie in eine Glasboden-Petri-Schale, die die äußere Lösung enthält. Nehmen Sie den Basisstrom in Abwesenheit von Dopamin auf.
Fügen Sie dann 10 µL einer ein Millimolar Dopaminlösung der Schale hinzu. Eine funktionstüchtige amperometrische Elektrode sollte einen Anstieg des oxidativen Stroms registrieren. Achten Sie darauf, die Integrität der amperometrischen Elektrode vor und nach den Experimenten zu überprüfen.
Bei diesem Verfahren holen Sie die Dopaminneurone oder Zellen, die zur Expression des Dopamintransporters modifiziert wurden und sich in der Petrischale mit Glasboden befinden, aus dem Inkubator. Waschen Sie die Zellen oder Dopaminneurone vorsichtig dreimal mit warmer äußerer Lösung. Um die Zellen zu visualisieren und das Experiment durchzuführen, befestigen Sie die Petrischale mit Glasboden auf dem Mikroskoptisch und stellen Sie den richtigen Fokuspunkt ein, um die Zellen klar zu sehen.
Als Nächstes wird ein positiver Druck auf die Patch-Elektrode ausgeübt. Mit einer Ein-Milliliter-Spritze werden beide Elektroden vorsichtig in die Lösung und näher an die Zelle herangeführt, indem die Mikromanipulatoren verwendet werden. Danach wird die empermetrische Elektrode auf der linken Seite der Zelle und die Patch-Elektrode auf der rechten Seite positioniert.
Wenn die Patch-Elektrode die Zelle berührt, leichtes Vakuum mittels Mund oder Spritze anlegen, um einen Giga-Seal auf der Zelle zu bilden. Danach den Seal durch weiteres Ansaugen durchbrechen, um die Ganzzell-Konfiguration zu erreichen, und fünf bis acht Minuten warten, damit die dialysierende, Dopamin enthaltende innere Lösung in die Zelle eindringen kann.
Zeichnen Sie dann die DAT-vermittelten Ströme auf, indem Sie die Zellmembranspannung von einem Haltepotential von minus 40 Millivolt über die Pipette zwischen minus 60 und plus 100 Millivolt variieren. Um den spezifischen, DAT-vermittelten Dopaminfluss zu bestimmen, nehmen Sie die empirischen Ströme in Abwesenheit und Gegenwart eines DAT-Antagonisten auf. Der spezifische, DAT-vermittelte Strom wird anschließend ermittelt, indem die in Gegenwart des DAT-Antagonisten aufgezeichneten Spuren von den empirischen Spuren ohne Antagonisten subtrahiert werden.
Eine nach oben gerichtete Ausschlagung in den Tric-Strömen entspricht einem nach außen gerichteten Dopaminfluss, der hier dargestellt ist. DAT-vermittelte Ströme wurden aufgezeichnet, indem die Membranspannung in Schritten von 20 Millivolt zwischen minus 60 und plus 100 Millivolt von einem Haltepotential von minus 40 Millivolt aus geändert, wobei die Pipette zwei Millimolar Dopamin enthielt, im Ganzzell-Patch-Modus. Hier ist der simultan zum Ganzzellstrom aufgezeichnete elektrometrische Strom.
Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man den reversen Transport von Dopamin über den Dopamintransporter in einer spannungsgestellten Nervenzelle misst. Denken Sie daran, die Integrität der parametrischen Elektrode vor und nach den Experimenten zu überprüfen, und vergessen Sie nicht, die Spuren, die in Gegenwart des Antagonisten aufgezeichnet wurden, von den Spuren abzuziehen, die ohne den Antagonisten aufgezeichnet wurden.
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Übersicht
In diesem Artikel wird eine Technik zur Messung des rückläufigen Transports von Dopamin in Neuronen unter Verwendung der simultanen Patch-Clamp- und Pyrometrie beschrieben. Die Methode ermöglicht die Beurteilung der Dopamintransporter (DAT)-vermittelten Freisetzung, während die Spannung des Neurons gesteuert wird.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Neurowissenschaften
- Elektrophysiologie
- Neurotransmitterdynamik
Hintergrund
- Dopamin ist ein entscheidender Neurotransmitter, der an verschiedenen Gehirnfunktionen beteiligt ist.
- Der Dopamintransporter spielt eine Schlüsselrolle bei der Regulierung der Dopaminspiegel.
- Das Verständnis von Umkehrtransportmechanismen ist entscheidend, um Einblicke in die dopaminerge Signalübertragung zu gewinnen.
- Diese Technik kombiniert die Spannungsclamp-Technik mit amperometrischen Messungen, um die Genauigkeit zu erhöhen.
Zweck der Studie
- Um den umgekehrten Transport von Dopamin in spannungsklammerten Neuronen zu messen.
- Um die Beziehung zwischen der Aktivität des Dopamin-Transporters und der Dopaminfreisetzung zu untersuchen.
- Um eine Methode zur Untersuchung der Funktion dopaminerger Neuronen in Echtzeit bereitzustellen.
Verwendete Methoden
- Überprüfung der Integrität der pyrometrischen Elektrode mit Dopamin.
- Herstellung einer Ganzzelle-Aufzeichnung des Neurons mithilfe einer Patch-Pipette.
- Steuerung der Zellspannung mittels der Patch-Pipette.
- Aufzeichnung der DAT-vermittelten Dopaminfreisetzung unter Verwendung der pyrometrischen Elektrode.
Hauptergebnisse
- Erfolgreiche Messung der Dopaminfreisetzung während der Spannungsfixierung.
- Nachweis der Wirkung von DAT-Hemmstoffen auf den Dopamintransport.
- Aufschluss über die regulatorischen Mechanismen des Dopamintransports gewonnen.
- Methode zur Untersuchung der neuronalen Dopamindynamik validiert.
Schlussfolgerungen
- Die Technik misst effektiv den rückläufigen Transport von Dopamin.
- Gleichzeitige Spannungssteuerung verbessert das Verständnis der DAT-Funktion.
- Diese Methode kann auf weitere Studien zur dopaminergen Signalübertragung angewendet werden.
Häufig gestellte Fragen
Ausschlaggebende Bedeutung für die Industrie
Diese Methode ermöglicht die direkte Messung des Dopaminausflusses über den Dopamintransporter unter Spannungssteuerung und liefert mechanistische Einblicke in die Funktion des Transporters, die für die Entdeckung neuropsychiatrischer Arzneimittel relevant sind. Durch die zeitlich aufgelöste Isolierung der DAT-vermittelten Freisetzung unterstützt sie die Zielvalidierung und reduziert Unsicherheiten bei Hypothesen zur dopaminergen Signalübertragung in Krankheitsmodellen. Der Ansatz erhöht die Vorhersagesicherheit in der frühen Forschung, indem er die Transporteraktivität mit der Dynamik der Neurotransmitter verknüpft.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Wissenschaftlicher Wert: Untersucht den Efflux-Mechanismus des Dopamintransporters, um das funktionelle Target-Engagement in lebenden Neuronen zu validieren.
- Operativer Wert: Ermöglicht gleichzeitige elektrophysiologische und amperometrische Aufzeichnungen, um das Membranpotenzial mit dem transportervermittelten Dopaminfluss zu korrelieren.
Screening und Assay-Entwicklung
- Wissenschaftlicher Wert: Erzeugt quantitative, zeitlich aufgelöste Messwerte des oxidativen Stroms, die die DAT-abhängige Dopaminausschüttung unter kontrollierten Spannungsschritten widerspiegeln.
- Operativer Wert: Etabliert ein reproduzierbares Assay-Format zur Messung transportervermittelter Effluxvorgänge und unterstützt die Substanzscreening-Untersuchung für DAT-Modulatoren.
Translationale und präklinische Forschung
- Wissenschaftlicher Wert: Verbindet die DAT-Ausstromaktivität mit der Homöostase des extrazellulären Dopamins und liefert damit Hinweise für Krankheitsmodelle, bei denen eine Dysfunktion des Transporters eine Rolle spielt.
- Operativer Wert: Bietet ein krankheitsrelevantes System, um genetische oder pharmakologische Störungen der Dopamintransporterfunktion zu bewerten.
Pipeline- und Workflow-Integration
Die Methode passt in frühe Entdeckungsworkflows, da sie eine mechanistische Risikominderung von Dopamintransporter-Zielen vor der Identifizierung von Leitstrukturen ermöglicht.
- Entdeckungsbiochemie: Unterstützt die Hypothesenprüfung von Transporter-Umkehrmechanismen und die Aufklärung von Wegen in dopaminergen Neuronen.
- Screening: Liefert assaysbereite, quantitative Ergebnisse zur Bewertung der Wirkung von Substanzen auf den DAT-vermittelten Efflux.
- Analytik: Ermöglicht simultane Ganzzellstrom- und amperometrische Messungen, um DAT-spezifische Signale durch pharmakologische Subtraktion zu isolieren.
- Translationale Forschung: Schafft Anschluss an die präklinische Kontinuität, indem Dopamin-Dysregulation in spannungsgeführten neuronalen Systemen modelliert wird.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Schafft eine wiederverwendbare Plattform zur Beurteilung der Transporterfunktion in verschiedenen neuronalen Modellen oder Krankheitskontexten.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Steigert das Vertrauen in die Zielvalidierung, indem die effluxvermittelte Dopaminausschüttung unter physiologischer Spannungssteuerung direkt gemessen wird.
- Operativer Wert: Fördert die Standardisierung von Assays durch synchronisierte Patch-Clamp- und Amperometriemessungen und verringert so die Variabilität bei der Quantifizierung des Neurotransmittereffluxes.
- Strategischer Wert: Verbessert Entscheidungen über Fortführung oder Abbruch von Projekten, indem der Wirkmechanismus des Transporters geklärt wird, wodurch späte Ausscheidungen aufgrund mechanistischer Fehlinterpretationen reduziert werden.
- Portfolio-Implikation: Ermöglicht die risikoadjustierte Priorisierung von DAT-gerichteten Wirkstoffen basierend auf funktionellen Daten zur Modulation des Effluxes.
Durchführungsaspekte
- Erfordert Fachkenntnisse in Elektrophysiologie, Amperometrie und neuronaler Kultur, um die Integrität der Elektroden und die Signalgenauigkeit aufrechtzuerhalten.
- Beruht auf geräuscharmen Messgeräten, einschließlich hydraulischer Manipulatoren, dualer Axopatch-200B-Verstärker und Kohlenstofffaserelektroden für simultane Ableitungen.
- Erfordert eine standardisierte Vorgehensweise zwischen den Forschungsteams hinsichtlich Spannungsprotokollen und Methoden zur Antagonisten-Subtraktion, um die Vergleichbarkeit zwischen Experimenten sicherzustellen.
- Beinhaltet Anpassungsüberlegungen für verschiedene neuronale Modelle, insbesondere bezüglich der Expression des Dopamintransporters und der Membranintegrität.
- Umfasst praktische Einschränkungen wie die Oxidation von Dopaminlösungen, die einen schützenden Umgang sowie die Validierung der Grundlinie vor und nach den Experimenten erfordern.
