Färbeprotokollen for Human Pankreasinseln
23. Mai 2012
Dieses Video zeigt Verfahren zur Charakterisierung von humanen Langerhans-Inseln mit Hämatoxylin und Eosin (H & E) und Immunhistochemie (IHC). Pankreas-Abschnitten von Kopf, Körper und Schwanz Regionen werden sowohl von H & E und IHC gefärbt, um Inselzellen endokrinen Zusammensetzung (Insulin, Glukagon und pankreatische Polypeptid), Zell-Replikation (Ki67) und entzündlichen Infiltraten (H & E, CD3) zu bestimmen. Die uncinatus Region lokalisiert ist mit IHC für pankreatische Polypeptid.
Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, humane Pankreasinseln mittels Hämatoxylin- und Eosin-Färbung sowie Immunhistochemie zu charakterisieren. Dies wird erreicht, indem Serienschnitte aus einer in einem Paraffinblock eingebetteten Pankreasprobe angefertigt werden. Die Schnitte werden anschließend in ihrer ursprünglichen Orientierung auf Objektträger aufgebracht.
Ein Teil der Objektträger wird mit Hämatin und Eosin gefärbt, während die verbleibenden Objektträger mittels Immunhistochemie gefärbt werden. Der letzte Schritt besteht darin, die gefärbten Objektträger einzuscannen und nach Fällen zu sortieren. Letztendlich können diese Bilder in eine Online-Pathologiedatenbank hochgeladen werden, wo sie von anderen Forschern auf diesem Gebiet eingesehen werden können. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden liegt darin, dass die Objektträger seriell gefärbt werden, wobei ihre ursprüngliche Orientierung erhalten bleibt.
Den Vorgang werden Linda Snyder, Histo-Technologin, Emily Montgomery, Biowissenschaftlerin, und Tiffany Hippo, Laborantin in meinem Labor, demonstrieren. Zunächst das Wasserbad und das Mikrotom gemäß den Standardverfahren für die Paraffinschnitttechnik einrichten. Danach positiv geladene Objektträger mit der Fallnummer, der Pankreasregion und der Objektträgernummer beschriften.
Nachdem alles vorbereitet ist, wird der Paraffinblock mit dem Kassettenetikett auf der linken Seite in die Mikrotomspindel eingespannt. Gemäß den üblichen Mikrotomieverfahren wird der Block solange geschnitten, bis das Gewebe gleichmäßig freigelegt ist. Sobald das Gewebe gleichmäßig erreicht ist, wird ein Band serieller Schnitte mit einer Dicke von etwa vier Mikrometern erzeugt.
Je nach Anzahl der erforderlichen Erstfärbungen werden drei bis sechs Schnitte benötigt. Danach die Schnitte des Bandes voneinander trennen. Jeden Schnitt der Reihe nach aufnehmen und auf einen Objektträger legen.
Notieren Sie die Schnittnummer mit einem Bleistift. Falls ein Schnitt unbrauchbar ist, lassen Sie diese Nummer aus und setzen Sie die Nummerierung der Schnitte in exakter Reihenfolge fort. Achten Sie darauf, die gleiche Orientierung auf dem Objektträger beizubehalten, wie sie im Kassettenbehälter vorlag, wobei die Objektträgerbeschriftung nach links ausgerichtet sein sollte.
Als Nächstes die Objektträger in einen Objektträgerkasten stellen und über Nacht trocknen lassen. Bei Raumtemperatur die Oberfläche des Paraffinblocks mit einer dünnen Paraffinschicht versiegeln, um das Gewebe zu konservieren, und den Block bei Raumtemperatur oder bei minus 20 Grad Celsius archivieren. Dieses Verfahren für die nächste Probe wiederholen.
Es ist wichtig, die Nummerierung der Serienschnitte auf jeder Ebene beizubehalten, wie oben für die H- und E-Färbung gezeigt. Legen Sie den ersten Objektträger von jedem Block in einen Objektträgerhalter und setzen Sie diesen anschließend in das erste Fach des Automatenfärbegeräts ein. Wählen Sie das Standard-HE-Programm aus und starten Sie den Färbeprozess.
Wenn die Färbung abgeschlossen ist, nehmen Sie die Objektträger vom Automatenstainer und legen Sie sie zur Deckglasauflage in die Abzugshaube. Bringen Sie mithilfe üblicher Techniken ein Deckglas auf jedem Objektträger an. Beschriften Sie die Objektträger schließlich mit einem bedruckten Etikett und lassen Sie sie gründlich in der Abzugshaube trocknen.
Beginnen Sie mit dem Einrichten des Automatenfärbegeräts und der Vorbereitung aller erforderlichen Reagenzien. Wählen Sie das Daco-Programm für Doppelfärbungen. Geben Sie die Anzahl der Objektträger und die jeweils zuzuordnende Behandlung ein.
Laden Sie alle Reagenzien gemäß den Herstellerempfehlungen in den Automatenfärbner. Bereiten Sie anschließend TBST und Citratpuffer, Antikörper und andere für das Verfahren erforderlichen Reagenzien vor. Entparaffinieren Sie die Objektträger, indem Sie sie fünf Minuten lang in Xylol geben.
Vermeiden Sie, dass die Objektträger austrocknen, da dies zu übermäßigem Hintergrund und Porenfärbung führt, während die Objektträger depa sind. Gießen Sie Zitratpuffer in einen Dampfgarer, um ihn vor der Verwendung vorzuheizen. Anschließend unterziehen Sie die depa-Objektträger einer Reihe von Ethanolwäschen.
Spülen Sie die Objektträger ein letztes Mal mit entionisiertem Wasser. Geben Sie die Objektträger in den vorgewärmten Citratpuffer und lassen Sie sie 30 Minuten lang dämpfen. Überführen Sie die Objektträger nach dieser Zeit unverzüglich in ein Wasserbad bei Raumtemperatur, bis sie vollständig abgekühlt sind.
Nach dem Abkühlen die Objektträger vorsichtig in die Dayco-Auto-Stainer-Gestelle überführen, wobei die richtige Reihenfolge beibehalten werden muss. Abschließend das zuvor geladene Doppelfärbungsprogramm starten. Nach Beendigung des Programms die Objektträger aus dem Automaten nehmen und mindestens eine Stunde lang trocknen lassen, bevor sie dehydriert werden.
Um die Dehydrierung fortzusetzen, überführen Sie sie für eine Minute in 80 % Ethanol. Setzen Sie die Dehydrierung der Objektträger fort, indem Sie diese in 95 % Ethanol und anschließend in 100 % Endstufe eintauchen. Zuletzt tauchen Sie die Objektträger in Xylol ein und halten sie dort eine Minute lang.
Die Objektträger sofort mit Deckgläsern unter Verwendung von Cyto Seal montieren, um den Vorgang abzuschließen. Etiketten ausdrucken, die die Fallinformationen enthalten, einschließlich Organ und Blocknummer, Art der Färbung und Datum. Ein Etikett auf jeden Objektträger kleben, um die gefärbten Objektträger scannen zu können.
Legen Sie sie auf ein Scannertablett und befolgen Sie die Standardverfahren. Archivieren Sie die gefärbten Objektträger bei Raumtemperatur und alle verbleibenden ungefärbten Objektträger bei minus 20 Grad Celsius für zukünftige Verwendung. Ordnen Sie abschließend die gefärbten Bilder nach Spender und Art des Gewebes.
Hier ist ein Beispiel für eine KI-67- und Insulin-Färbung bei niedriger und hoher Vergrößerung. Bilder der gefärbten Pankreas-Schnitte werden in eine Online-Pathologiedatenbank eingestellt, die eine virtuelle Biobank bildet. Mithilfe dieser Datenbank können Forscher schnell auf Informationen zugreifen, die für die Forschung und die Typ-1-Diabetes-Erkrankung benötigt werden.
Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man hochwertige Präparate aus dem menschlichen Pankreas herstellt und anfärbt.
Sehen Sie sich das vollständige Transkript an und erhalten Sie Zugang zu Tausenden wissenschaftlicher Videos
Übersicht
Dieses Video zeigt Verfahren zur Charakterisierung menschlicher Pankreasinseln mittels Hämatoxylin- und Eosin-Färbung (H&E) und Immunhistochemie (IHC). Die Methode ermöglicht die Beurteilung der endokrinen Zusammensetzung der Inseln, der Zellreplikation sowie von entzündlichen Infiltraten.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Neurowissenschaften
- Endokrinologie
- Histologie
Hintergrund
- Menschliche Pankreasinseln spielen eine entscheidende Rolle im Glukosestoffwechsel.
- Die Charakterisierung der Inselzusammensetzung ist entscheidend für das Verständnis von Diabetes.
- H&E- und IHC-Färbungen sind Standardverfahren für die Gewebeanalyse.
- Die Beibehaltung der ursprünglichen Orientierung der Schnitte ist entscheidend für eine genaue Beurteilung.
Zweck der Studie
- Charakterisierung menschlicher pankreatischer Inseln.
- Bestimmung der endokrinen Zusammensetzung der Inseln.
- Beurteilung der Zellreplikation und entzündlichen Reaktionen.
Verwendete Methoden
- Erstellung serieller Schnitte aus paraffin-eingebetteten Pankreasproben.
- Färbung der Schnitte mit H&E und IHC.
- Durchsicht gefärbter Objektträger zur Analyse.
- Sortierung der Bilder nach Fällen für den Upload in die Datenbank.
Hauptergebnisse
- Nachweis von Insulin, Glucagon und Pankreas-Polypeptid in den Inseln.
- Beurteilung der Zellreplikation mittels Ki67-Färbung.
- Beurteilung inflammatorischer Infiltrate durch H&E- und CD3-Färbung.
- Erfolgreiche Lokalisation des Uncinatus-Areals mittels immunhistochemischer Färbung (IHC).
Schlussfolgerungen
- Die Methode ermöglicht eine umfassende Charakterisierung der Pankreasinseln.
- Die Beibehaltung der ursprünglichen Objektträgerorientierung verbessert die Genauigkeit der Analyse.
- Die Ergebnisse tragen zum Verständnis der Pankreasfunktion in Gesundheit und Krankheit bei.
Häufig gestellte Fragen
Ausschlaggebende Bedeutung für die Industrie
Standardisierte histopathologische Arbeitsabläufe für humane Pankreasinseln ermöglichen eine reproduzierbare Charakterisierung endokriner Zellen und unterstützen die Validierung von Zielstrukturen in der Diabetesforschung. Durch die Erhaltung der Orientierung serieller Schnitte und die Erstellung digitalisierter Ganzpräparataufnahmen erleichtert die Methode den datenbasierten Austausch zwischen Fachdisziplinen sowie das Biobanking zur mechanistischen Absicherung von Inselzell-gerichteten Therapien. Dieser Ansatz erhöht die Vorhersagesicherheit in präklinischen Modellen, indem er quantifizierbare, räumlich aufgelöste Daten zur Inselzusammensetzung, -replikation und immunzellulären Infiltraten bereitstellt.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Wissenschaftlicher Wert: Ermöglicht die Überprüfung therapeutischer Hypothesen durch rigorose histopathologische Untersuchungen und Immunlokalisation von Insel-Endokrinelementen.
- Operationaler Wert: Unterstützt die biologische Risikominderung durch Charakterisierung der Inselmorphologie, -größe, -dichte und der Zusammensetzung endokriner Zellen mittels H&E- und IHC-Färbungen.
- Prädiktiver Wert: Hilft bei der Portfolio-Priorisierung durch Bewertung der Inselreplikation und apoptotischer Zellen mittels Ki67 und anderer Proliferationsmarker.
Screening und Assay-Entwicklung
- Wissenschaftlicher Wert: Bereitet validierte biologische Systeme für nachgeschaltete Workflows vor, indem die menschliche Bauchspeicheldrüse durch standardisierte Aufarbeitung in definierte Regionen (Kopf, Körper, Schwanz) und Querschnitte unterteilt wird.
- Operationaler Wert: Trägt zur Standardisierung und Reproduzierbarkeit von Assays bei, indem Unterteilungen numerisch und alphabetisch entsprechend ihrer Größe gekennzeichnet werden, um eine vollständige Analyse der Querschnitte zu ermöglichen.
- Plattform-Wert: Unterstreicht die Eignung für Hochdurchsatz-Screenings und Skalierbarkeit durch digitalisierte Ganzpräparatbilder, die in einer Online-Pathologiedatenbank organisiert sind und über 200 Forschern zugänglich gemacht werden.
Translationale und präklinische Forschung
- Wissenschaftlicher Wert: Diskutiert die Krankheitsrelevanz, indem Inseln auf Entzündungen, Fibrose, Amyloid und T-Zell-Infiltrate mittels H&E- und CD3-Färbung untersucht werden.
- Operationaler Wert: Beschreibt die Kontinuität von der Entdeckung bis zur präklinischen Validierung durch die Beurteilung sowohl endokriner als auch exokriner Kompartimente, einschließlich duktulärer Pathologie und Neoplasie.
- Risikoadjustierte Weiterentwicklung: Konzentriert sich auf die prädiktive Entlastung von Risiken durch die Charakterisierung intraduktaler Pankreasneoplasien und deren Beziehung zum Duktussystem.
Pipeline- und Workflow-Integration
Die Methode integriert sich in den Entdeckungsprozess von der frühen Target-Validierung bis zur präklinischen Bewertung, indem sie Serienschnitte, standardisierte Färbungen und das digitale Biobanking von menschlichem Pankreasgewebe ermöglicht.
- Entdeckungsbiologie: Unterstützt die Hypothesenprüfung und Klärung von Signalwegen durch Histopathologie und Immunlokalisierung von Pankreasinseln und endokrinen Zellen.
- Screening: Stellt die Bereitschaft und Reproduzierbarkeit von Assays sicher, indem die ursprüngliche Objektträgerorientierung während der seriellen Schnittführung und Reihenfärbung beibehalten wird.
- Analytik: Betont quantitative Messungen der Inselarea, Inselanzahl, Zusammensetzung endokriner Zellen, Zellreplikation und T-Zell-Infiltrate mittels H&E- und IHC-Färbung, um den Vergleich zwischen verschiedenen Bedingungen zu ermöglichen.
- Translationale Forschung: Schafft Anschluss an die präklinische Kontinuität, indem Inselamyloid, Fibrose und entzündliche Infiltrate bewertet werden, die für die Pathogenese des Typ-1-Diabetes relevant sind.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Positioniert die Methode als wiederverwendbare Kapazität durch eine Online-Pathologiedatenbank, die einen schnellen Datenaustausch sowie die Auswahl von Blöcken für paraffin- oder gefrorene Serienschnitte ermöglicht.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Vorhersagegenauigkeit, Zielvalidierung, Verringerung mechanistischer Uneindeutigkeit bezüglich der endokrinen Zusammensetzung der Inseln und ihrer immunologischen Wechselwirkungen.
- Operationaler Wert: Standardisierung, Reproduzierbarkeit und Skalierbarkeit von seriellen Schnitten, Färbungen und der digitalen Archivierung von Objektträgern.
- Strategischer Wert: Verbesserte Go/No-Go-Entscheidungen, Kapital-Effizienz und verringertes biologisches Risiko in späteren Phasen durch frühzeitige Identifizierung von Insel-Pathologien und Replikationsstatus.
- Portfolio-Wirkung: Risikoadjustierte Priorisierungs- und Förderentscheidungen basierend auf quantifizierbarer Insel-Morphologie, Dichte und endokrinen Zellphänotypen.
Durchführungsüberlegungen
- Notwendige wissenschaftliche Fachkenntnisse in Histotechnologie, Immunhistochemie und digitalen Pathologie-Workflows.
- Erforderliche Instrumentierung und analytische Infrastruktur, einschließlich Mikrotom, Automatenfärbegerät, Objektträgerscanner und Zugang zu einer Online-Pathologie-Datenbank.
- Standardisierungsanforderungen über mehrere Teams hinweg hinsichtlich der Objektträgerbeschriftung, Schnittnummerierung und Aufrechterhaltung der Orientierung zwischen Histologie- und Bildgebungsteams.
- Überlegungen zur Anpassung an verschiedene Modellsysteme, insbesondere zur Anwendung standardisierter regionaler Aufarbeitung (Kopf, Körper, Schwanz) auf nichtmenschliche Pankreasorgane.
- Zu den praktischen Einschränkungen gehören die Gewebevariabilität von Organ spendenden Spendern und die Notwendigkeit einer optimierten Antikörper-Validierung für multiplex Immunhistochemie-Färbungen.
