Chirurgische Verfahren für eine Ratte Modell Teilweise Lebertransplantation mit arteriellen Rekonstruktion

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, eine partielle orthotope Lebertransplantation bei Ratten als reproduzierbares experimentelles Modell für die Transplantationsforschung durchzuführen. Dies wird erreicht, indem zunächst die Leber aus der Spender-Ratte exzidiert wird. Der zweite Schritt ist die ex vivo-Präparation des Lebertransplantats, einschließlich einer 50 %igen Leberresektion.

Anschließend wird die native Leber der Empfängerratte entfernt. Der letzte Schritt ist die Implantation des teilweisen Lebertransplantats in die Empfängerratte. Abschließend werden die Serumspiegel von Alaninaminotransferase gemessen, um die hepatzelluläre Schädigung des Lebertransplantats nach der Transplantation zu bewerten.

Im Allgemeinen haben Personen, die neu in diesem Verfahren sind, aufgrund der Komplexität, die fortgeschrittene mikrochirurgische Fähigkeiten erfordert, Schwierigkeiten. Um dieses Verfahren zu beginnen, stellen Sie die anästhetisierte Spender-Ratte nach Bestätigung durch eine Zehenquetschung, dass das Tier vollständig anästhesiert ist, auf eine Heizplatte und fixieren Sie die Vorderbeine mit dem magnetischen Fixator-Retraktionssystem. Rasieren Sie das Fell aus dem gesamten Bauchbereich der Ratte und desinfizieren Sie die entsprechende Haut mit einer PVP-Jod-Lösung.

Öffnen Sie den Bauchraum durch einen medianen Schnitt mit beidseitigen Erweiterungen. Legen Sie eine Fünf-Milliliter-Spritze unter den Rücken der Ratte, sodass die vena cava suprahepatica mit einer feinen Pinzette ventral angehoben wird; ziehen Sie den Vorgang in Richtung Kopf und setzen Sie die subkostalen Retraktoren ein, um das Operationsfeld freizulegen. Da während des Eingriffs häufig an den Retraktoren und der Fünf-Milliliter-Spritze manipuliert werden muss, werden keine chirurgischen Tücher um den Schnitt herum verwendet. Unter einem Operationsmikroskop mit 16-facher Vergrößerung arbeitet man das falciforme Ligament und das linke trianguläre Ligament wie eine Acht aus, durchtrennt die linke phrenische Vene und hebt die mediale und linke laterale Leberlappen mit einem feuchten Gazetupfer nach oben.

Unter Verwendung von bipolaren Pinzetten die paraösophagealen Gefäße zwischen dem linken lateralen und dem anterioren koordinaten Lappen koagulieren und durchtrennen. Den Darm außerhalb des Abdomens nach links zur Seite der Ratte verlagern und mit einem feuchten Mulltupfer abdecken. Mit einem feuchten Tupfer abtupfen, den rechten Seitenlappen mit einem feuchten Gore-Tupfer nach oben reträhen.

Isolieren Sie die infrahepatische Vena cava aus dem retroperitonealen Gewebe und ligieren Sie die rechte Nebennierenvene, die später kurz vor der Transplantatentnahme durchtrennt wird, um einen Stent in den Ductus choledochus einzubringen. Ligieren Sie zunächst den Ductus choledochus auf der Höhe der Abzweigung der Arteria gastroduodenalis. Führen Sie einen kleinen Schnitt in die vordere Wand des Ductus choledochus proximal zur ligierten Stelle ein, halten Sie dann mit der linken Hand die vordere Wand der Schnittstelle mit einer geraden Mikrozange fest und verwenden Sie mit der rechten Hand eine gebogene Mikrozange, um den Stent in den Ductus einzuführen. Sichern Sie den Stent mit einem Seidenfaden der Stärke 6-0.

Belassen Sie ein abgeschnittenes Ende des Fadens an der Gallenwege in einer Länge von vier Millimetern, damit der Faden während der späteren Anastomose gehalten werden kann. Freilegen der Pfortader durch Ligatur und Durchtrennung der Venen der Leberläppchen und der Milzvene. Ligieren und durchtrennen Sie die Arteria gastroduodenalis. Isolieren Sie dann die Arteria hepatica communis vom Pankaskopf bis zu ihrer Wurzel.

Drehen Sie die Leber mit Wattestäbchen nach rechts und dissezieren Sie das Bandgewebe um die Rückseite der Leber und der Speiseröhre herum, und zwar am Ende der Vorbereitungen. Zur Leberexzision entfernen Sie die Retraktoren, die Moskito-Forceps am Xiphoidprozess und die Fünf-Milliliter-Spritze unterhalb der Rückseite der Ratte.

Bringen Sie die Därme in die Bauchhöhle zurück. Injizieren Sie 500 IE Heparin natrium in zwei Milliliter physiologischer Kochsalzlösung durch die Penisschlagader. Etwa drei Minuten später setzen Sie die Fünf-Milliliter-Spritze, die feine Pinzette und den Retraktor ein, um die Arteria hepatica communis proximal ihrer Wurzel zu ligieren.

Halten Sie eines der abgeschnittenen Enden des Fadens für die A. hepatica communis bereit. Lange Zeit nach dem Abklemmen der vena cava infrarenalis. In der Nähe der Vena renalis dextra mit einer feinen Pinzette.

Die Vena portae mit einer Einweg-Mikrogefäßklemme unterhalb des Stumpfes der Vena lienalis abklemmen. Die vordere Wand der Vena portae eröffnen und einen 18-Gauge-Katheter in die Vena portae einführen. Die Leber *in situ* mit 60 Milliliter kalter Histidin-Tryptophan-Ketoglutarat-Lösung über die Vena portae perfundieren.

Bei einem hydrostatischen Druck von 20 Zentimetern durchtrennte das Wasser sofort das Zwerchfell, die intrathorakale Vena cava und die vordere Wand der infrahepatischen Vena cava, um die Perfusionslösung aus der Leber auszuspülen. Klemmen Sie die infrahepatische Vena cava mit einer Mikrogefäszange direkt unterhalb der Leber ab. Entfernen Sie die Leber, indem Sie die infrahepatische Vena cava freilegen und durchtrennen.

Die Pfortader, das Zwerchfell, die verbleibenden Bänder, die rechte Nebennierenvene und die A. hepatica communis. Legen Sie die entnommene Leber in kalte HTK-Lösung in einer Metallschale, die in einer mit zerstoßenem Eis gefüllten Plastikbox platziert ist. Die Verfahren am Lebertransplantat werden in der Metallschale durchgeführt, die mit eiskalter HTK-Lösung gefüllt ist, um eine Hülse an der Pfortader anzubringen. Klemmen Sie den Pfortaderstamm mit einer DeBakey-Bulldog-Klemme und platzieren Sie die Klemme in einer Brückenposition über der Schale.

Führen Sie die Pfortader durch die Manschette und klemmen Sie die Arteria lienalis erneut zusammen mit der Verlängerung der Manschette in der 12-Uhr-Position. Stülpen Sie die Wand der Pfortader über die Manschette, um den Stumpf der Vena lienalis außerhalb der Manschette in der 7-Uhr-Position zu positionieren, und fixieren Sie die Pfortader mit einem Seidenfaden der Stärke 6-0, um einen Stent in die A. hepatica einzubringen. Fixieren Sie die Leber, indem Sie mit einer Pinzette beide Ränder des Zwerchfells abklemmen, und ziehen Sie die A. hepatica communis gerade, indem Sie den ligatierten Faden mit der DeBakey-Bulldog-Klemme halten, wobei gerade Mikroscheren verwendet werden. Führen Sie mit der linken Hand einen kleinen Schnitt in der vorderen Wand der A. hepatica communis durch.

Halten Sie die vordere Wand des Schnittes mit einer geraden Mikrozange fest und führen Sie mit der rechten Hand einen Stent in die Arteria hepatica communis ein. Befestigen Sie den Stent mit einer Seidennaht der Stärke sechs Null mithilfe einer gebogenen Mikrozange und lassen Sie eines der abgeschnittenen Enden der Naht mit einer Länge von vier Millimetern stehen. Spülen Sie die Leber über den arteriellen Katheter mit fünf Millilitern kalter HTK-Lösung für die 50 %-Leberresektion aus.

Zunächst wird der hintere Koordinatenlappen mit einer feinen Pinzette festgeklemmt, um ihn zu fixieren. Anschließend wird sein Stiel mit einem 4-0-Seidenfaden ligiert und der Lappen reseziert.

Der vordere corate Lappen wird auf die gleiche Weise entfernt. Danach wird die Kunststoffbox um 90 Grad gedreht. Klemmen Sie den rechten Rand des Zwerchfells und den linken Teil des mittleren Lappens.

Erstellen Sie einen kleinen Einschnitt an der oberen Grenze des Randes der bilateralen Anteile des medialen Lappens und entfernen Sie anschließend den linken Anteil nach der Ligatur. Nach der Ligatur des Stieles mit einer 4-0-Seidennaht wird der linke laterale Lappen entfernt; die resezierte Leberoberfläche wird sorgfältig mit bipolarer Pinzette kauterisiert. Die Lebermasse ist nun um etwa 50 % reduziert zur Plastik der suprahepatischen Vena cava.

Zunächst fixieren Sie die Position der Leber, indem Sie beide Ränder des Zwerchfells mit einer feinen Pinzette klemmen. Anschließend beschneiden Sie die vordere Wand der suprahepatischen Vena cava, indem Sie das entsprechende Zwerchfell entfernen. Bringen Sie von außen nach innen je eine 7-0-Polypropylonnaht an beiden Ecken als Haltenähte für die spätere Anastomose an.

Anschließend wird die hintere Wand der suprahepatischen Vena cava präpariert. Die Lebertransplantat wird bei vier Grad Celsius in HTK-Lösung im kalten Wasserbad aufbewahrt. Der Empfänger wird ähnlich wie beim Spender eingehend für die Operation vorbereitet und der Bauchraum durch eine mediane Laparotomie eröffnet.

Legen Sie einen feuchten Tupfer auf die rechte Seite des Duodenums und des gesamten Darms. Um ein Operationsfeld um die infrahepatische Vena cava zu erhalten. Platzieren Sie die linke laterale und die mediale Leberlappen in der linken Subphrenikhöhle und ziehen Sie den rechten lateralen Leberlappen mit einem feuchten Tupfer nach oben.

Isolieren Sie die infrahepatische Vena cava aus dem retroperitonealen Gewebe, ligieren und durchtrennen Sie die rechte Nebennierenvene mit feuchtem Mull und Wattestäbchen. Drehen Sie die Leber nach links und dissezieren Sie das Bandgewebe um die Hinterseite der Leber. Durchtrennen Sie den Ductus choledochus direkt unterhalb des Zweigs aus dem linken Leberlappen.

Belassen Sie eines der durchtrennten Enden des Fadens für den Gallengang, der vier Millimeter lang ligiert wird. Ligieren und durchtrennen Sie die A. gastroduodenalis und die A. hepatica propria im Abstand von drei Millimetern zur Abzweigung von der A. hepatica communis, um eine weite Gefäßstruktur am Ende der A. hepatica communis zu erhalten. Klemmen Sie die infrahepatische Vena cava mit einer Metallmikrogefässklemme direkt oberhalb der rechten Nierenvene und die Vena portae auf Höhe ihrer Aufzweigung im Leberhilus mit einer Mosquitoklemme. Klemmen Sie die suprahepatische Vena cava zusammen mit dem Zwerchfell mithilfe einer peripheren Gefäßklemme und befestigen Sie die Klemme in einem Klumpen ölbasiertem Ton. Reduzieren Sie die Anästhesie mit Isofluran auf 0,4 Volumenprozent. Entfernen Sie die native Leber des Empfängers, indem Sie die suprahäpatische Vena cava am Übergang zwischen der suprahepatischen Vena cava und der Leber präparieren.

Die Pfortader knapp oberhalb der Kieferspitze der Moskito-Klemme und die infrahepatische Vena cava leicht unterhalb des Mittelpunkts zwischen Leber und rechter Nierenvene. Platzieren Sie das Lebertransplantat orthotop. Die Rekonstruktion der Gefäße ist der schwierigste und wichtigste Teil dieses Verfahrens.

Es muss sehr sorgfältig, aber schnell vorgegangen werden, um die Anastomose der suprahäpatischen Vena cava durch kontinuierliche Naht durchzuführen. Setzen Sie die Haltenaht an der suprahäpatischen Vena cava des Empfängers von innen nach außen mit der beigefügten 7-0-Polypropylen-Naht am rechten Winkel des Transplantats und verknoten Sie sie auf die gleiche Weise. Setzen Sie die zweite Haltenaht am linken Winkel an.

Dies ist der Startstich einer Laufnaht. Um die Anastomose zu erweitern, fassen Sie die Nähte an beiden Ecken mit DeBakey-Clamps unter leichter lateraler Zugkraft nach oben an und halten Sie sie fest. Stechen Sie anschließend am linken Eckpunkt von außen nach innen nahe dem Knoten außerhalb durch die Wand auf der Graft-Seite und nähen Sie die hintere Nahtreihe der vena cava saphena intraluminal mit sieben bis acht Stichen bis zum rechten Eckpunkt.

Legen Sie die ersten Nähte sorgfältig an, sodass die inneren Lumina sich an der rechten Ecke gegenüberliegen. Durchstechen Sie das Sieben-Null-Polypropylen durch das Gefäß von der Graft-Seite nach außen. Nähen Sie die vordere Reihe von außen von rechts nach links mit etwa 10 Stichen.

Spülen Sie das Innere mit Ringer-Laktat-Lösung aus. Um Luftblasen zu entfernen, führen Sie den letzten Stich nahe der Haltenaht aus und verknoten Sie diese gemeinsam. Zur Rekonstruktion der Pfortader klemmen Sie die Pfortader mit einer Mikrogefässklemme ab und befestigen die Moskitoklemme in der Tonmasse. Schneiden Sie anschließend die vordere Wand der Pfortader direkt unterhalb der Backe der Moskitoklemme an.

Spülen Sie das Innere der Empfänger-Pfortader und die Manschette mit Ringer-Laktat-Lösung. Führen Sie die Manschette in die Pfortader ein und fixieren Sie sie mit einem umlaufenden Seidenfaden (6-0). Schließlich wird die Leber reperfundiert.

Entfernen Sie die Fünf-Milliliter-Spritze vom Hinterende der Ratte und erhöhen Sie die Konzentration von Isofluran auf 0,8 Volumenprozent für die Rekonstruktion der Leberarterie mittels Stent-Technik. Halten Sie zunächst den Faden der A. hepatica propria mit einer feinen Pinzette fest und fixieren Sie ihn in der Tonmasse. Danach klemmen Sie die gemeinsame Leberarterie des Empfängers ab.

Erstellen Sie einen kleinen Einschnitt an der Gabelung der Y-Struktur am Ende der Arteria hepatica communis, um eine trichterförmige Öffnung zu bilden. Halten Sie das im Transplantat der Arteria hepatica communis platzierte Stent mit einer gebogenen Mikrozange fest. Schieben Sie das Stent in die Arteria hepatica communis des Empfängers und sichern Sie es mit einer Seidenfadenbindung (6-0), indem Sie ein Ende dieses Fadens zusammen mit dem vier Millimeter langen Faden am Transplantat der Arteria hepatica communis verknoten, sodass sich beide Arteriae hepaticae communes annähern und die Spannung an der Anastomosestelle verringert wird.

Danach lösen Sie die Klemme am Infrahepatischen Vena-cava-Anastomosierungsabschnitt durch eine kontinuierliche Naht in gleicher Weise wie beim suprahepatischen Vena cava, verwenden jedoch mehr Stiche mit feineren Einstichen. Nach der Entklemmung erhöhen Sie die Anästhesiekonzentration auf 1,0 Volumenprozent für die Rekonstruktion des Gallengangs. Halten Sie den Faden des Empfänger-Gallengangs mit einer Moskito-Klemme fest und fixieren Sie ihn in der Lehmplatte.

Führen Sie einen kleinen Schnitt im Gallengang auf der geeigneten Höhe durch, sodass der rekonstruierte Gallengang nicht zu lang wird. Setzen Sie die Stent ein und sichern Sie ihn mit einem Seidenfaden der Stärke sechs Null. Knoten Sie diesen Faden zusammen mit dem Faden am Transplantatgang.

Nun sind alle Rekonstruktionsverfahren abgeschlossen. Schließen Sie die Bauchdeckeninzision durch fortlaufende 4-0-Vicryl-Nähte in Schichten. Unmittelbar nach der Operation behandeln Sie die Empfängerratte mit einer subkutanen Injektion von Sphero-Natrium und Buprenorphin in insgesamt 1,5 Milliliter physiologischer Kochsalzlösung.

Lassen Sie die Ratte 60 Minuten lang in einem speziellen Käfig für die Intensivpflege mit Warmluft und Sauerstoffversorgung regenerieren, bevor sie in einen normalen Käfig zurückgebracht wird. Alle Empfängerratten überlebten bis zur geplanten Euthanasie zur Blutentnahme nach 1, 3, 24 und 168 Stunden nach der portalen Reperfusion. Die Serumproben wurden auf die Konzentration von Alanin-Aminotransferase analysiert, die das Ausmaß der hepatozellulären Schädigung der Lebertransplantate nach der Transplantation widerspiegelt.

Wie in diesem Graft dargestellt, erreichten die LT-Spiegel nach 24 Stunden einen Höchstwert und gingen danach bis zu den normalen Werten nach 168 Stunden zurück. Nach diesem Video sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man eine teilweise Lebertransplantation bei Ratten als reproduzierbares experimentelles Modell für die Transplantationsforschung durchführt.