C. elegans Tracking und Behavioral Measurement

Phänotypisierung. Die Lokomotion von *C. elegans* ist ein wichtiges Werkzeug für die Identifizierung von Genen und Neuronen, die an dem Verhalten von *C. elegans* beteiligt sind. *C. elegans* zeigt stereotypische Bewegungsmuster wie Vorwärts- und Rückwärtsbewegungen sowie verschiedene Arten von Kurven, indem es seine Körperform verändert. Um diese Bewegungen über weite Strecken und mit hoher räumlicher und zeitlicher Auflösung zu quantifizieren, haben wir einen Wurmspurenverfolger entwickelt, der die Bewegung von *C. elegans* erfasst, während er auf der Oberfläche einer Agarplatte kriecht.

Wir haben außerdem Software entwickelt, um diese Bewegungen mithilfe benutzerdefinierter Programme, die in LabVIEW und MATLAB geschrieben wurden, quantitativ zu isolieren und zu analysieren. Eine Herausforderung aller Videosysteme zur Bewegungsverfolgung besteht darin, dass sie eine enorme Menge an hochdimensionalen Daten erzeugen. Unser Bildverarbeitungs- und Datenanalyseprogramm begegnet dieser Herausforderung, indem es die Wurmformen in eine Reihe unabhängiger Komponenten reduziert; wir haben das Wurmverhalten dadurch umfassend als Funktion von lediglich drei bis vier Dimensionen rekonstruiert.

Eine Agarplatte wird von einer Faser-Lichtquelle beleuchtet und mit einer Kamera abgebildet. Dieses System ist auf einer XY-Translationsstufe montiert. Die Stufe wird durch handelsübliche Schrittmotoren bewegt, die mit einem Schrittmotorenregler verbunden sind.

Die Steuerungseinheit und die Kamera sind mit dem Computer verbunden und werden über im Labor entwickelte Programme in LabVIEW gesteuert. Die Kamera erfasst die Oberfläche einer Agarplatte und erkennt dunkle Objekte vor hellem Hintergrund. Eine Kalibrierungsmarke für den automatischen Kalibrierungsprozess wird erstellt, indem die Agaroberfläche angebohrt wird.

Mit einem Wurmlöffel wird die Bildqualität so eingestellt, dass das Computerprogramm Objekte in Echtzeit quantifizieren kann. Der Verstärkungsfaktor, die Helligkeit und die Verschlusszeit der Kamera können angepasst werden, um ein dunkles Objekt auf weißem Hintergrund darzustellen. Das gefilterte binäre Bild, das vom Verfolgungsprogramm verwendet wird, kann überprüft werden.

Die Software verfügt über eine automatische Kalibrierungsfunktion, die die Kalibriermatrix berechnet, indem ein Testobjekt um eine feste Distanz bewegt wird. Die Abstände in Pixeln werden mithilfe der Kalibriermatrix auf die Schritte des Schrittmotors bezogen.

Nach der Kalibrierung ist das System betriebsbereit und muss nicht erneut kalibriert werden, es sei denn, die Vergrößerung wird geändert oder die Kamera neu positioniert. Ein Kupferring wird verwendet, um die Würmer zusammenzutreiben und daran zu hindern, an den Rand der Platte zu wandern. Erwärmen Sie den Ring zuerst, indem Sie ihn auf einen Wärmespeicher oder ein gleichwertiges Gerät legen.

Der Ring sollte ungefähr eine Minute lang erhitzt werden. Legen Sie den Ring auf eine frische Agarplatte und drücken Sie leicht darauf, um ihn in die Agaroberfläche einzubetten. Eine mit NGM-Puffer gefüllte Agarplatte dient zum Waschen von Nahrungsrückständen von Würmern im L4- und jungen Erwachsenenstadium.

Nachdem die Würmer in den NGM-Puffer gelegt wurden, lässt man sie einige Minuten lang schwimmen. Man platziert vorsichtig einen der gewaschenen Würmer nahe dem Zentrum des Rings auf die Tracking-Platte. Diese Platte wird später für den Wurm-Tracker verwendet.

Stellen Sie die vorbereitete Platte auf die Wurm-Tracking-Bühne. Führen Sie das Lab-View-Programm aus und wählen Sie gegebenenfalls Optionen wie Speicherort für Bilder, Bildtypen, Messungen und Kameraeinstellungen. Bewegen Sie mithilfe des Joysticks das Mikroskop, bis ein Bild des Wurms im Sichtfeld auf dem Computerbildschirm erscheint.

Dann drücken Sie „Track“, um das Verfolgungsprogramm zu starten. Hier sehen wir einen Wurm, der in Echtzeit verfolgt wird. Das Computerprogramm misst die Bewegungen von binär gefilterten Bildern, wie dargestellt, und kann Messungen an diesem Bild in Echtzeit durchführen.

Nach der Verfolgung kann eine Rekonstruktion der globalen Trajektorie anhand der Bewegungen des Schrittmotors erstellt werden, während die lokalen Formveränderungen des Wurms im Detail sichtbar sind. Würmer bewegen sich durch wellenförmige Bewegungen fort. Wir erfassen diese Bewegungen, indem wir den Wurm zu einer einzigen Mittellinie skelettieren und diese Kurve anschließend als Menge von Winkeln beschreiben.

Anschließend zerlegen wir die Skelette in ihre grundlegenden Formen, die auch als Eigenvektoren bekannt sind. Mit diesen Eigenmodi können wir die Wurmformen rekonstruieren und die Bewegungen des Wurms quantifizieren. Mithilfe der ersten beiden Modi können wir gezielt die Phasenposition des wellenförmigen Bewegungszyklus des Wurms erfassen, wie im zweiten Panel dargestellt.

Das erste Diagramm zeigt die gemeinsame Verteilung der Modi eins und zwei und verdeutlicht einen kreisförmigen Grenzzyklus. Die Phasenbewegung in eine Richtung entspricht einer Vorwärtsbewegung, und die Phasenbewegung in die entgegengesetzte Richtung entspricht einer Rückwärtsbewegung. Somit entspricht die Phasengeschwindigkeit der Geschwindigkeit des Wurms.

Im Realraum ist die starke Korrelation zwischen Phase und Geschwindigkeit in der realen Welt im letzten Panel zu erkennen. Mithilfe der aus dem Eigenmodus abgeleiteten Phasengeschwindigkeit können wir einige subtile Details des Bewegungsverhaltens der Würmer aufdecken, die mit bloßem Auge übersehen würden. Beispielsweise zeigt die gemeinsame Verteilung der Phasengeschwindigkeit und der Phase deutlich, dass die Würmer den Vorwärtszustand bevorzugt zu bestimmten Phasen der Bewegung verlassen und betreten.

Hier haben wir ein einfach zu bedienendes Verfolgungssystem vorgestellt, das detaillierte Bilder des Verhaltens von Silikon beim Kriechen auf der Oberfläche und auf ACA-Platten aufzeichnet. Die Menge an Informationen, die in diesen Bildern enthalten ist, ist enorm und hochgradig mehrdimensional. Daher haben wir außerdem eine Methode entwickelt, um die Dimensionalität der Daten auf vier grundlegende Maße zu reduzieren. Diese Maße sind im Hinblick auf das Wurmverhalten leicht zu interpretieren.

Diese Arbeit dient der Messung des Verhaltens von Würmern bei geringen Modifikationen, und das System kann außerdem zur Messung neuronaler Aktivität unter Verwendung genetisch codierter und belichteter Bereiche eingesetzt werden. Das System ist insgesamt flexibel in der Konstruktion und kann mit anderen Kriechsystemen wie Doof-Gesetz, LOEs verwendet werden.