Probenahme menschliche Speichel Indigene Peptidoms Mit einem Lollipop-Like Ultrafiltration Sonde: vereinfachen und erweitern Peptid-Erkennung für Klinische Massenspektrometrie
7. August 2012
Angesichts Speichel Probenahme für zukünftige klinische Anwendung wurde ein Lollipop-ähnliche Ultrafiltration (LLUF) Sonde hergestellt, um in die menschliche Mundhöhle passen. Direkte Analyse von unverdauten Speichel mit nanoLC-LTQ Massenspektrometrie zeigten die Fähigkeit von LLUF Sonden, um große Proteine und hohe Abundanz Proteine zu entfernen, und machen Low-reiche Peptide mehr nachweisbar.
Diese Untersuchung der Speichel-Peptide nutzt eine lutscherähnliche Ultraschnellfiltrationssonde, gefolgt von einer direkten nano-LC-LTQ-Massenspektrometrie-Analyse. Zunächst wird die LLUF-Sonde unter Verwendung einer Polyethersulfon-Membran und einer Ethylen-Propylen-Röhre zusammengesetzt. Anschließend werden Speichelproben von Freiwilligen gesammelt und mittels der LLUF-Sonde aufgenommen, um den Speichel zu analysieren.
Danach unmittelbar zur nano-L-C-L-T-Q-Massenspektrometrie übergehen und die Daten von Speichelproben mit und ohne LLUF-Sondenbehandlung analysieren. Letztendlich kann das Speichelpeptid durch Analyse der L-C-M-S-S-Daten und Vergleich der identifizierten Peptide zwischen den beiden Proben erhalten werden. Dieser Ansatz, bei dem eine lutscherartige Ultrafiltrationssonde mit einer direkten nano-LC-LTQ-Massenspektrometrie-Analyse gekoppelt wird, bietet entscheidende Vorteile gegenüber anderen Methoden, wie beispielsweise dem Verdauen von Speichelproteinen in Peptide.
Anschließend an die Massenspektrometrie-Analyse vereinfacht und reinigt das LUF PRO die Speichelflüssigkeit und verbessert zudem die MS-Detektion von Peptiden im Gesamtspeichel für die klinische Anwendung. Versiegeln Sie die Polyetherschaum-Membranen mit Epoxidharzkleber an den Rändern der dreieckigen Polypropylen-Spateln. Befestigen Sie dann ein Teflon-Fluor-Ethylen-Propylen-Rohr an einem Zylinderausgang eines Dreiecks.
Die Proben mit einem Polypropylen-Spatel sterilisieren und mit 70 %igem Alkohol über Nacht behandeln, um die korrekte Versiegelung zu überprüfen; tauchen Sie die LLUF-Proben in eine 50 Milligramm pro Milliliter starke Lösung von Blauem Dextran für zwei Stunden ein. Bestätigen Sie das Fehlen von Blauem Dextran in den gesammelten Proben.
Rekrutieren Sie gesunde Freiwillige im Alter von 20 bis 40 Jahren. Bitten Sie die Versuchsperson nach einer Mundspülung mit Wasser, Speichelproben in ein mit Eis gekühltes Gefäß zu spucken. Vereinigen Sie alle Proben und lagern Sie sie auf Eis.
Unmittelbar nach der Sammlung in einen Raum mit vier Grad Celsius gehen und 200 Mikroliter Speichel für die Probenahme mit LLUF-Probenahmeköpfen bereitstellen. Nun die Polyetherschaum-Membran in einer Kulturschale in menschlichen Speichel eintauchen. Durch das Zurückziehen eines Spritzenkolbens Unterdruck erzeugen, um einen Ultrafiltrationsprozess zur Probenentnahme aus dem Speichel zu simulieren.
Als Nächstes bestimmen Sie die Protein-Konzentrationen. Bereiten Sie je ein Mikrogramm pro Mikroliter der Speichelproteinproben für die Nano-LC-Massenspektrometrie-Analyse vor. Für die Probenauswertung verwenden wir eine Exigent Nano-LC, die online mit einem Finnegan LTQ-Massenspektrometer gekoppelt ist. Laden Sie zunächst fünf Mikroliter der undigierten Speichelproben mittels Autosampler auf die Trap-Säule des Nano-LC-Systems.
Nach einem Waschschritt wechseln Sie das Ventil und leiten einen linearen Gradienten von 0 bis 50 % Puffer B zur Fang- und C18-Trennsäule. Sammeln Sie im datenabhängigen Modus von Excalibur die MS/MS-Spektren der vier stärksten MS-Ionen mit einer Intensität über 1 × 10⁴. Führen Sie für jede Probe doppelte Analysen von drei verschiedenen separaten Präparationen durch.
Danach importieren Sie die Datendatei in das Sequester Sorcerer Two-System und wählen eine Suche gegen eine geeignete menschliche NCBI-Proteindatenbank unter Verwendung der Nicht-Enzym-Spezifität. Nach der Sequester-Suche werden die Ergebnisse automatisch gefiltert, validiert und in Peptide Prophet und Protein Prophet basierend auf den Sequester-Ergebnissen angezeigt. Peptide Prophet schätzt eine umfassende Wahrscheinlichkeits-P-Score ein, der angibt, ob die Zuordnung eines Peptids korrekt oder inkorrekt ist, und identifiziert zudem zusätzliche Informationen zu jeder Peptidsequenz.
Der Protein-„profit“ berechnet anhand der den Ms.Ms-Spektren zugeordneten Peptide für jedes Protein einen Wahrscheinlichkeitswert zwischen null und eins. Dieser Abschnitt untersucht die Fähigkeit von LLUF-Sonden, orale Bakterien zur bakteriellen Nachweiskultur zu entfernen, wobei Speichelproben vor und nach der Gewinnung mittels LLUF-Sonden auf Auger-Platten auf aerobe Bakterien getestet werden. Verwenden Sie antibiotikafreie LB-Auger-Platten bei 37 Grad Celsius für einen Tag; für anaerobe Bakterien verwenden Sie eine Gaspackung zur Kultur.
Die Probe wird einen Tag lang auf Bru-Brühe in Auger-Platten unter anaeroben Bedingungen bei 37 Grad Celsius inkubiert. Die Herstellung von Lolli-ähnlichen Ultrafiltrationsvorrichtungen erleichtert die Probenahme von Speichel in einem nachgeahmten oralen Milieu. In diesem System wird eine negativ geladene Polyether-Handymembran mit einer Molekulargewichtsabscheidung bei 30 Kilodalton auf einen Polypropylenrührer geklebt und vor der LLUF-Sonde positioniert, um größere Proteine im Speichel auszufiltern.
Um die menschliche orale Umgebung nachzuahmen, wird ein Schwamm mit Speichel mittels einer Spritze getränkt. Der Speichel wird über das angeschlossene Rohr gefiltert und gesammelt. Der Vergleich von LC-Chromatogrammen von Speichel vor und nach der LLUF-Probenahme führte zur Identifizierung indigener Speichelpeptide mittels Nano-L-C-L-T-Massenspektrometrie.
Da diese differentiellen Chromatogramme ohne chemische oder enzymatische Verdauung gewonnen werden, vereinfachen sie die Probenvorbereitung für klinische Zwecke. In dieser Probe identifizierte die LLUF anhand der unterschiedlichen Proteinzusammensetzungen 131 Peptide in unverdautem Speichel.
Diese Peptide sind Fragmente, die aus verschiedenen prolinreichen Proteinen stammen. Aktin, Alpha-Amylase, Alpha-1-Globin, Beta-Globin, His-Sustain-1, Keratin, Mucin-7, polymere immunoglobuline Rezeptor, Serin und S-100. A 9 26 einzigartige Peptide, die im Speichel nach der Filtration mit LLUF-Sonden identifiziert wurden, sind hauptsächlich Fragmente verschiedener prolinreicher Proteine.
Dieses aus Alpha-Amylase stammende Peptid wurde ausschließlich in einer Speichelprobe nachgewiesen, die ohne Sammlung mit LLUF-Probenahmesonden erfolgte, was die Fähigkeit der LLUF-Probenahmesonden verdeutlicht, große Proteine zu entfernen. Am bemerkenswertesten ist, dass nach dem Entfernen größerer Proteine mehrere Sequenzpeptide in der mit LLUF-Probenahmesonden gewonnenen Speichelprobe detektiert werden konnten; insbesondere Peptide mit prolinreichen C-Termini wurden in den Proben nach Ultrafiltration mittels LLUF-Probenahmesonden identifiziert. Sie sollten nun ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie A-L-L-L-L-U-F PRO zur einfachen Speichelentnahme für die Massenspektrometrie verwenden können.
Eine bessere Analyse ist sehr wichtig, um Speichel unter konsistenten Bedingungen zu sammeln und einfach zu handhaben. Einmal beherrscht, glaube ich, dass diese Technik innerhalb von drei Stunden ordnungsgemäß durchgeführt werden kann. Dieser Ansatz mit einem lutscherähnlichen Ultrafiltrationsprobengeber in Kombination mit direkter nano-LC-MS/MS-Spektrenkettenanalyse erleichtert klinische Anwendungen für Biomarker bei der Diagnose menschlicher Krankheiten.
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Übersicht
Diese Studie untersucht die Verwendung einer lutscherartigen Ultrafiltrationssonde (LLUF) zur Speichelentnahme, wodurch die Detektion von wenig vorhandenen Peptiden verbessert wird. Die LLUF-Sonde entfernt effektiv große und hochabundante Proteine und ermöglicht so eine direkte Analyse mittels NanoLC-LTQ-Massenspektrometrie.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Neurowissenschaften
- Biokemie
- Analytische Chemie
Hintergrund
- Speichel ist eine wertvolle biologische Flüssigkeit für die klinische Diagnostik.
- Herkömmliche Methoden erfordern oft eine Proteindigestion, was die Analyse erschwert.
- Ultrafiltrationstechniken können die Peptidnachweisempfindlichkeit verbessern.
- Die Massenspektrometrie ist ein leistungsfähiges Werkzeug zur Analyse komplexer biologischer Proben.
Zweck der Studie
- Entwicklung einer neuartigen LLUF-Sonde für die Speichelprobenentnahme.
- Verbesserung des Nachweises von niedrig abundanten Peptiden im Speichel.
- Vergleich der Wirksamkeit der LLUF-Behandlung mit herkömmlichen Methoden.
Verwendete Methoden
- Herstellung der LLUF-Sonde unter Verwendung einer Polyetherschaum-Membran aus einem Handy und eines Ethylen-Propylen-Schlauchs.
- Sammlung von Speichelproben von Freiwilligen.
- Aufarbeitung des Speichels mittels der LLUF-Sonde.
- Direkte Analyse der Proben mittels NanoLC-LTQ-Massenspektrometrie.
Hauptergebnisse
- LLUF-Sonden entfernten erfolgreich große und hochabundante Proteine.
- Nach der Behandlung wurden niedrigabundante Peptide besser detektierbar.
- Die direkte Analyse ergab klarere Ergebnisse im Vergleich zu traditionellen Methoden.
- Der Ansatz bietet erhebliche Vorteile für klinische Anwendungen.
Schlussfolgerungen
- Die LLUF-Sonde ist ein aussichtsreiches Werkzeug für die Speichelanlyse.
- Sie verbessert die Detektion von Peptiden, ohne dass eine Proteindigestion erforderlich ist.
- Diese Methode könnte die klinische Diagnostik unter Verwendung von Speichelproben verbessern.
Häufig gestellte Fragen
Aussagekräftige Relevanz für die Industrie
Die Probennahme des endogenen Speichel-Peptidoms des Menschen ohne enzymatische Verdauung löst einen zentralen Engpass bei der Biomarker-Entdeckung für die klinische Massenspektrometrie. Die lutscherartige Ultrafiltrations-(LLUF-)Sonde ermöglicht den direkten Nachweis von Peptiden mit geringer Häufigkeit, indem sie Proteine und Partikel mit hoher Konzentration entfernt und somit die Probenvorbereitung für translationale Anwendungen vereinfacht. Dieser Ansatz unterstützt die Validierung von Zielstrukturen in einem frühen Stadium und die Absicherung von Wirkmechanismen, indem er reproduzierbaren Zugriff auf krankheitsrelevante Peptidsignale in einer nichtinvasiven Körperflüssigkeit ermöglicht.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Wissenschaftlicher Wert: Ermöglicht die Untersuchung endogener Peptidfragmente, die aus prolinreichen Proteinen und anderen Speichelkomponenten stammen, zur Überprüfung von Biomarker-Hypothesen.
- Operativer Wert: Beseitigt die Trypsinverdauung und Zentrifugationsschritte, reduziert damit die präanalytische Variabilität und beschleunigt den Workflow von der Probe bis zur MS-Analyse.
Screening und Assay-Entwicklung
- Wissenschaftlicher Wert: Erzeugt Peptidprofile, die angereichert sind für Spezies mit geringer Häufigkeit, und verbessert so die Empfindlichkeit von Assays zum Nachweis krankheitsassoziierter Modifikationen.
- Operativer Wert: Erzeugt konsistente, von Verunreinigungen befreite Proben, die für LC-MS-basierte Screening-Kampagnen mit hoher Reproduzierbarkeit geeignet sind.
Translationale und präklinische Forschung
- Wissenschaftlicher Wert: Unterstützt die Überwachung des Krankheitsverlaufs, indem native Peptidmuster erfasst werden, die für die proteolytische Aktivität im oralen Mikromilieu charakteristisch sind.
- Operationeller Wert: Ermöglicht eine Längsschnittprobennahme in klinischen Umgebungen, da die Probengewinnung minimalinvasiv ist und auf einer sondebasierten Methode beruht, die sich für den Einsatz am Versorgungsort eignet.
Pipeline- und Workflow-Integration
Die LLUF-Sonde passt in den Entdeckungsprozess von der Hypothesengenerierung bis zur präklinischen Validierung ein, insbesondere dort, wo eine peptidbasierte Auflösung in komplexen Körperflüssigkeiten ohne enzymatische Verzerrung erforderlich ist.
- Entdeckungsbiochemie: Ermöglicht die Hypothesenprüfung durch den Zugang zum indigenen Peptidom für die Anreicherung von Signalwegen und die Zielstruktur-Entschlüsselung.
- Screening: Stellt reproduzierbare, frei von Fraktionierung entstehende Peptid-Extrakte bereit, die eine zuverlässige Untersuchung von Wirkstoffen oder Biomarkern im Speichel ermöglichen.
- Analytik: Liefert quantitative Peptid-Auswertungen mittels direkter nanoLC-MS und unterstützt somit den vergleichenden Analysen über verschiedene Bedingungen oder Zeitpunkte hinweg.
- Translationale Forschung: Stützt die Kontinuität von Biomarkern, indem klinisch relevante Peptide erfasst werden, die in nicht-invasiven Flüssigkeiten nachweisbar sind.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Stellt eine modulare Probennahmeschnittstelle dar, die in verschiedenen Speichelstudien anpassbar ist und eine skalierbare Anwendung in Entdeckungs- und Validierungsphasen ermöglicht.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Erhöht die Vorhersagesicherheit beim Nachweis von Peptiden, indem die Probenvielfalt verringert und der Verlust von seltenen Spezies minimiert wird.
- Operativer Wert: Standardisiert die Speichelprobenahme durch einen geschlossenen, spritzenbetriebenen Ultrafiltrationsprozess, der unabhängig von der Zentrifugation ist.
- Strategischer Wert: Verringert die Rate technischer Ausfälle bei der biomarkerbasierten Entdeckung mittels Massenspektrometrie und verbessert die Effizienz von Go/No-Go-Entscheidungen in frühen Entwicklungsphasen.
- Portfolio-Implikation: Ermöglicht die risikobasierte Weiterentwicklung von Speichelbiomarker-Kandidaten durch verbesserte Datenqualität und Reproduzierbarkeit.
Durchführungsaspekte
- Erfordert Fachkenntnisse in der Sondenmontage, der Handhabung von Speichel sowie der Bedienung von nanoLC-MS.
- Hängt von der Verfügbarkeit von Ultrafiltrationsmembranen mit definiertem MWCO und biokompatiblen Schläuchen für den oralen Einsatz ab.
- Benötigt standardisierte Protokolle für die Probenahme von Freiwilligen, die Sterilisation der Sonde und die Validierung der Blockierung (z. B. Ausschluss von blauem Dextran).
- Beinhaltet Anpassungen hinsichtlich unterschiedlicher Speichelviskosität, Flussraten und spenderspezifischer Eigenschaften.
- Ist durch die molekulare Gewichtsschranke der Membran begrenzt, die bestimmte Peptid-Protein-Komplexe oder größere Biomarker ausschließen kann.
