Reinigung und Aggregation des Amyloid Precursor Protein intrazelluläre Domäne

Das Ziel dieses Verfahrens ist es, die intrazelluläre Domäne des Amyloid-Vorläuferproteins, auch bekannt als A ICD, zu reinigen, und eine Anleitung zur thermischen Aggregation und Charakterisierung der A ICD mittels Rasterkraftmikroskopie bereitzustellen. Dies wird erreicht, indem zunächst eine A GST-Fusion der A ICD in Bakterien exprimiert wird. Anschließend wird das GST-A-I-C-D-Protein gereinigt, mit Thrombin gespalten, um das GST von der A ICD zu trennen, und das GST wird entfernt.

Dann wird die thermische Aggregation von A ICD induziert. Schließlich werden die A ICD-Aggregate mittels Rasterkraftmikroskopie abgebildet. Letztendlich können Ergebnisse erhalten werden, die zeigen, dass A ICD in ausreichender Menge für biochemische und biophysikalische Analysen homogen gereinigt werden kann.

Der Hauptvorteil dieser Methode gegenüber bestehenden Verfahren, die komplexe Chromatographieschritte erfordern, besteht darin, dass hochreines und lösliches A ICD am einfachen Labortisch mit Standardreagenzien und -geräten isoliert werden kann. Ein nach diesem Protokoll hergestelltes A ICD eignet sich für weitere biochemische und biophysikalische Charakterisierungen.

Die Durchführung des Verfahrens wird Amina ti übernehmen. Dr. Andres Oberer, ehemaliger Postdoktorand in meinem Labor, wird demonstrieren, wie die Abbildung mittels Rasterkraftmikroskopie von A ICD durchgeführt wird. Um den rekombinanten intrazellulären Bereich von A PP beziehungsweise A ICD zu exprimieren, beginnen Sie mit BL21-Zellen, die mit dem pgx41-Vektor transformiert wurden und die humane A ICD, fusioniert an das C-Terminus von GST, enthalten. Inokulieren Sie mit einer einzelnen Kolonie 10 Milliliter LB-Bouillon mit Ampicillin und inkubieren Sie über Nacht bei 37 Grad Celsius mit intensivem Schütteln. Am folgenden Morgen fahren Sie fort.

Brüten Sie 400 Milliliter LB-Ampicillin in einem Ein-Liter-Kolben mit fünf Milliliter der Übernachtkultur. Inkubieren Sie bei 37 Grad Celsius mit starkem Schütteln, bis die optische Dichte bei 600 Nanometern 0,4 bis 0,6 erreicht hat. Dies dauert normalerweise zwei bis 2,5 Stunden, um die Expression von G-S-T-A-I-C-D zu induzieren.

Wir geben 0,4 Millimolar IPTG hinzu und inkubieren bei 37 Grad Celsius mit starkem Schütteln für fünf Stunden. Zentrifugieren Sie die Zellen bei 6.000 × g für 15 Minuten bei vier Grad Celsius und lagern Sie das Pellet bei minus 80 Grad Celsius. Nachdem Sie den Lysepuffer vorbereitet und die Bakterien auf Eis gelegt haben, geben Sie 20 Milliliter Puffer zum Pellet hinzu und mischen gründlich mithilfe einer Kombination aus Vortexen und Pipettieren auf Eis.

Den bakteriellen Pellet in Reese resuspendieren und die so erhaltene bakterielle Lysatlösung durch einen vorab gekühlten Emulgierer oder eine French-Presse leiten. Bei 30.000 PSI das Lysat ein zweites Mal durch den Emulgierer pressen und das Lysat in einem vorab gekühlten 50-Milliliter-Röhrchen auffangen. Das Lysat bei 15.000 × g und 4 °C 30 Minuten lang zentrifugieren.

Das Überstand getrennt abpipettieren und in eine vorab gekühlte 50-Milliliter-Röhrchen überführen. 500 Mikroliter einer 50 %igen Glutathion-Agarose-Suspension hinzufügen. 30 Minuten bei vier Grad Celsius unter Rühren inkubieren.

Stellen Sie den Elutionspuffer frisch nach der Inkubation her. Gießen Sie das Lysat und die Suspension in eine wegwerfbare fünfzöllige Polystyrol-Chromatographiesäule mit groben Filtern. Spülen Sie die Säule fünfmal mit je drei Milliliter PBS.

Stopfen Sie das untere Ende der Säule ab und geben Sie 500 Mikroliter Elutionspuffer bei Raumtemperatur hinzu. Verschließen Sie das obere Ende der Säule und rotieren Sie sie fünf Minuten bei Raumtemperatur. Sammeln Sie die frühe Fraktion in einem gekühlten 1,5-Milliliter-Mikrofugegefäß.

Wiederholen Sie die Elution noch zweimal. Dialysieren Sie das Eluat am folgenden Tag über Nacht in einer Dialysiermembran mit einer Molekulargewichtsabscheidung von 10.000 bei vier Litern PBS und vier Grad Celsius. Dialysieren Sie anschließend gegen weitere vier Liter PBS bei vier Grad Celsius für eine Stunde.

Entfernen Sie das Protein aus der Dialysiskassette und führen Sie einen Proteinquantifizierungsassay durch, um die Ausbeute von G-S-T-A-I-C-D zu bestimmen. Eine typische Aufreinigung aus 400 Milliliter Kultur ergibt mehr als 20 Milligramm gereinigtes Protein bei Konzentrationen von 10 bis 20 Milligramm pro Milliliter. Portionieren Sie das Protein in Aliquots zu je 200 Mikroliter und frieren Sie es bei minus 80 Grad Celsius ein.

Um das A-ICD aus der GST-Fusion freizusetzen, tauen Sie 200 Mikroliter gereinigtes GST-A-ICD auf und geben 20 Mikroliter einer Einheit pro Mikroliter Thrombin hinzu. Inkubieren Sie die Probe über Nacht bei 37 Grad Celsius. Am folgenden Tag entfernen Sie aggregiertes Material durch Zentrifugation bei 20.000 ×g für 30 Minuten bei vier Grad Celsius. Überführen Sie das Überstand in ein vorab gekühltes Mikrogefäss, um GST und Thrombin zu entfernen. Geben Sie jeweils 50 Mikroliter einer 50 %igen Glutathion-Agarose-Suspension und 50 Mikroliter einer 50 %igen P-Aminoazyl-Agarose-Suspension hinzu.

Ansatz unter Rühren fünf Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. Kurz zentrifugieren, um die Agarosekügelchen abzuscheiden, und das Überstand in ein frisches Gefäß überführen. Den GST-Fusionsprotein-Partikel viermal erneut mit Glutathion extrahieren.

Aros führt einen Proteinbestimmungs-Assay mit fünf Mikrolitern des gereinigten A ICD durch. Typische Ausbeuten aus einer 400-Milliliter-Kultur liegen bei 50 bis 100 Mikrogramm mit einer Konzentration von 0,2 bis 0,5 Milligramm pro Milliliter. Nachdem das frisch präparierte A ICD in PBS auf eine Konzentration von 0,1 Milligramm pro Milliliter verdünnt wurde, wurde eine thermisch induzierte Aggregation durch Inkubation der Proben bei 43 Grad Celsius über 48 Stunden in einem beheizten Schüttler mit 800 U/min ausgelöst.

Verdünnen Sie die Probe 20-fach mit entionisiertem Wasser und geben Sie zwei Mikroliter auf frisch gespaltene Mica. Trocknen Sie die Probe über Nacht in einem Exsikkator, um die aggregierten A-ICD mit Rasterkraftmikroskopie im Tapping-Modus unter Verwendung von goldbeschichteten Mikro-Sharpp-Nitrid-Federn mit einem nominalen Spitzenradius von zwei Nanometern zu visualisieren.

Typische Tipp-Amplituden während der Abbildung liegen bei 10 bis 20 Nanometern an der Resonanzfrequenz der Cantilever. Die Expression und relative Anreicherung von G-S-T-A-I-C-D wird hier gezeigt. Nach der Lyse befindet sich der größte Teil des Fusionsproteins in der löslichen Fraktion, sodass eine Extraktion aus Einschlusskörperchen nicht erforderlich ist.

Das aus der Glutathion-Elutions-Säule eluierte Material ist zu mehr als 95 % rein. Bei der hier gezeigten Aufbereitung betrug die Konzentration des aus der Säule eluierten Proteins 14,5 Milligramm pro Milliliter, und die Ausbeute lag bei 22 Milligramm. Die Spaltung von 200 Mikrolitern dieser Aufbereitung über Nacht mit 20 Einheiten Thrombin führte zu einer nahezu 100 %igen Spaltung des Fusionsproteins.

Die verwendete Menge an Thrombin ist so gering, dass sie mit Kumasi nicht nachweisbar ist. Die Färbung mit Blau und die Entfernung von Thrombin und GST führten zu einem gewissen Materialverlust. Dennoch betrug die Reinheit über 90 %, wobei die Ausbeute bei dieser Präparation 70 Mikrogramm A ICD mit einer Konzentration von 0,35 Milligramm pro Milliliter betrug.

Ein ICD-Aggregat, abgebildet mittels FM, ist typischerweise steroidartig, amorph und weist eine Größe zwischen 50 und 100 Nanometern auf. Aggregiertes Material ist nicht nachweisbar, wenn eine äquimolare Menge des Chaperons UBI Quillin eins zur Aggregationsreaktion hinzugefügt wird. Nachdem Sie dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man EICD reinigt, dessen Aggregation induziert und Aggregate mittels A-F-M-E-I-C-D abbildet.

Mit dieser Technik gereinigte Proben können in anderen Methoden wie Lichtstreuung und Filtertrapping-Assays eingesetzt werden, um Fragen bezüglich des Einflusses molekularer Chaperone auf die Aggregation von EACD zu beantworten.