Multi-Target-Parallel Processing Ansatz zur Gene-to-Struktur Bestimmung der Influenza Polymerase PB2-Untereinheit

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments besteht darin, einen multimodularen Ansatz zur strukturellen Aufklärung eines Zielproteins mittels Röntgenkristallographie anzuwenden, ausgehend von lediglich einem einzelnen Gen oder einer genetischen Sequenz, wie im vorliegenden Fall dargestellt. Das Zielprotein ist die PB2-Polymerase-Untereinheit von Influenza A, eine Schlüsselkomponente der viralen Replikation. Der multimodulare Ansatz wird erreicht, indem zunächst eine Reihe genetischer Konstrukte parallel konzipiert und kloniert wird, basierend auf der einzelnen Zielsequenz und weiteren bekannten Informationen über das Protein.

Der zweite Schritt besteht darin, die Expressionslevel für jeden Konstrukt zu testen und die besten für die großtechnische Proteinsynthese in Zellkultur auszuwählen. Im nächsten Schritt müssen die Zellen aufgebrochen werden, um die Zielproteine vom Expressionsmaterial zu trennen, und jedes Protein muss auf hohe Reinheit angereichert werden. Anschließend werden eine Reihe von Kristallisationsversuchen mit jedem Protein durchgeführt, um eine Kristallform zu erhalten, die für Röntgenuntersuchungen geeignet ist.

Im Anschluss werden an einem oder mehreren Kristallen Röntgenbeugungsdaten mit hoher Auflösung gesammelt und zur Ermittlung sowie Verbesserung einer Elektronendichtekarte verwendet, die die Struktur jedes Zielproteins darstellt. Diese Ergebnisse ermöglichen die Darstellung einer dreidimensionalen Struktur des Zielproteins basierend auf der Elektronendichtekarte. Die gleichzeitige Bearbeitung mehrerer Zielstrukturen erhöht die Erfolgschancen bei der Strukturaufklärung erheblich, da sie an jedem möglichen Hindernis im Verlauf des Prozesses alternative Ansätze bereitstellt.

Die gleichzeitige Bearbeitung mehrerer Zielstrukturen ist ebenfalls äußerst effizient und reduziert Zeit und Kosten pro Protein in jedem Schritt. Das Potenzial, die Rate zu erhöhen, mit der die Strukturaufklärung für pharmakologisch angreifbare Zielstrukturen abgeschlossen wird, ermöglicht mehr Therapieentwicklungsmöglichkeiten pro Jahr. Obwohl diese Methode wertvolle Einblicke in die Strukturbiologie liefern kann, eignet sich das hochwertige Protein, das mit diesen Methoden gewonnen wird, für jede proteinbasierte Untersuchung.

Jede Phase des Verfahrens hat ihre eigene Wissenschaft und erfordert spezifisches Fachwissen, doch die Investition in Personal, Geräte und Know-how kann sich durchaus auszahlen, sobald alle Bestandteile zusammengestellt sind. Sobald ein Zielgen und dessen Genprodukt für die Untersuchung ausgewählt wurden, erfordert der erste Schritt die Konzeption mehrerer genetischer Varianten oder Konstrukte. Zur Gestaltung dieser Konstrukte auf der Proteinebene sowie des zugehörigen Codes in künstlich hergestellten Gensequenzen wird Gen-Composer-Software verwendet.

Unter Verwendung des Alignments-Ansichtsmoduls und des Konstrukt-Design-Moduls vergleichen Sie Proteinsequenzalignments und definieren Sie die Design-Einsatz-PCR und Vektor-PCR-Terminalprimer oder Ampere für Protein-Konstrukte. Anschließend verwenden Sie den Protein-zu-DNA-Algorithmus von Gene Composer, um jede Aminosäuresequenz in eine kodierende, technisch gestaltete Nukleinsäuresequenz rückzutranslatieren. Nutzen Sie die entsprechende Kodonverwendungstabelle, um die Sequenz für die Expression in einer bestimmten Zelllinie zu optimieren.

In diesem Fall Bakterien der Art Escherichia coli. Sobald die Sequenz des Zielgens vorliegt, das Gen virtuell klonen und in ein geeignetes Vektor-Plasmid für die bakterielle Expression einfügen. In diesem Fall ein modifiziertes PET-28-Vektor.

Dieser Vektor enthält bestimmte Komponenten, die für die Expression und die Proteinreinigung notwendig sind. Das Zielgen wird so modifiziert, dass eine Histidin-Tag-Sequenz an das N- oder C-Terminus des Proteins sowie eine Spaltsequenz zur Entfernung des Tags während der Reinigung angefügt wird. Der Vektor besitzt außerdem ein Antibiotikaresistenzgen für die Expressionstestung und Fermentation.

Jede genetische Sequenz des Zielproteins wird anschließend mittels standardmäßiger Gensynthesemethoden hergestellt, um die pipe-Klonierung, auch polymerase incomplete primary extension cloning genannt, vorzubereiten. Bei dieser PCR-basierten Klonierungsstrategie wird das Zielgen mit Primern amplifiziert, die komplementär zum vorgesehenen Vektor sind. Diese Methode nutzt die unvollständige Amplifikation im späten Stadium der PCR aus, wodurch die PCR-Produkte variable einsträngige Enden aufweisen. Ich bereite den Insert-PCR (IPCR) vor, indem ich jeweils fünf Mikroliter des Vorwärts- und des Rückwärtsprimers zu jeder Reaktion hinzugebe.

In einer 96-Well-Platte gemäß einer Plattenkarte zwei Mikroliter jedes vollständigen synthetischen Gens entsprechend der Plattenkarte in das jeweils passende Well geben. Nach Zugabe von 25 Mikrolitern PFU-Mastermix zu jedem Well die Reaktionen 25 Zyklen lang unter den folgenden PCR-Bedingungen durchführen. Denaturierung bei 95 Grad Celsius für 30 Sekunden.

Anil bei 50 Grad Celsius für 45 Sekunden und Verlängerung bei 68 Grad Celsius für drei Minuten. Die Fragmentvermehrung wird durch AGROS-Gel-Analyse der IPCR-Produkte bestätigt. Erfolgreiche IPCR-Produkte zeigen sich als intensive Banden im Gel.

Weniger gewünschte Ergebnisse zeigen sich oft als schwache oder verschmierte Banden in einer separaten Reaktion. Das Expressionsplasmid wird durch Vektor-PCR oder VPCR-Fragmentverstärkung bestätigt durch AROS-Gelelektrophorese der VPCR-Produkte. Sobald die IPCR- und VPCR-Produkte amplifiziert sind, werden sie einer Mischplatte hinzugefügt und zur Durchführung der Merge-Reaktion in einen Thermocycler gegeben.

Die erfolgreich klonierten Konstrukte werden anschließend in chemisch kompetente E. coli-Zellen transformiert und in Glycerin-Stäbchen gelagert, um die Expressions-Test-Abstriche zu beginnen. Eine kleine Menge jeder Probe aus einem Glycerin-Lager des klonierten Konstrukts wird auf eine separate Agarplatte übertragen. Die Platte wird mit bakterieller Nährbouillon und dem im Vektor kodierten Antibiotikum-Marker Kanamycin hergestellt und am folgenden Tag über Nacht bei 37 Grad Celsius inkubiert.

Beginnen Sie für jede Probe eine Vorkultur, indem Sie eine einzelne Kolonie von der frisch angezüchteten Agarplatte auswählen. Verwenden Sie diese Kolonie, um 1,2 Milliliter TB-Bouillon, angereichert mit Canamycin und Glukose, zur parallelen Verarbeitung anzusetzen. Jede Vorkultur wird in einem 96-Loch-Rundbodenblock gezüchtet.

Übernacht bei 37 Grad Celsius mit Schütteln bei 220 Umdrehungen pro Minute inkubieren. Nach dem Übernachtwachstum kleine Induktionskulturen für jede Probe ansatzweise ansetzen, indem 40 µL der Vorkultur zur Inokulation verwendet werden.

1,2 Milliliter TB-Bouillon, ergänzt mit 50 Milligramm pro Milliliter Canamycin und Novagen Overnight Express System. Züchten Sie die Induktionskulturen bei 20 Grad Celsius für 48 Stunden unter Schütteln bei 220 U/min. Gewinnen Sie die Zellen durch Zentrifugation bei 4.000 G-Kraft-Einheiten für 15 Minuten.

Den Überstand abgießen und die Pellets vor der weiteren Verarbeitung nach der Reinigung mindestens eine Stunde bei minus 20 Grad Celsius lagern. Analysieren Sie das Protein mit und ohne Spaltreaktion mittels Kapillarelektrophorese unter Verwendung eines Caliper Lab CHIP 90-Systems gemäß Herstellerprotokoll. Im Fall des Influenza-A-PB2-Proteinsubunits führten 14 der 34 Konstrukte zu löslichem Zielprotein und gingen in den nächsten Schritt, die großtechnische Fermentation, über.

Um eine großangelegte Fermentation zu beginnen, impfen Sie 100 Milliliter Bakterienzellkulturbrühe, die 50 Milligramm pro Milliliter Can mycin enthalten, aus einer Glycerinlagerkultur an und kultivieren Sie über Nacht bei 37 Grad Celsius. Am folgenden Tag erweitern Sie die Vorkultur, indem Sie 10 Milliliter verwenden, um unter Schütteln bei 220 U/min anzusetzen.

Ein Liter Brühe, die Autoinduktionsmedium und 50 Milligramm pro Milliliter Canamycin in einem zwei Liter fassenden Schüttelkolben mit Siedehilfen enthält. Die kultivierten Kulturen bei 37 Grad Celsius mit etwa 30 Umdrehungen pro Minute schütteln. Die optische Dichte der Kultur durch Messung der UV-Absorption bei einer Wellenlänge von 600 Nanometern überprüfen.

Wenn eine optische Dichte von 0,6 erreicht ist, stellen Sie nach der gewünschten Wachstumszeit die Temperatur des Schüttlagers auf 20 Grad Celsius um. Entnehmen Sie aus jedem Konstrukt eine repräsentative 10-Milliliter-Aliquot zur Expressionsprüfung. Gewinnen Sie die Zellen durch Zentrifugation bei 5.000 GForce-Einheiten für 15 Minuten.

Den Überstand abgießen und das Zellpellet bei minus 80 Grad Celsius einfrieren. Um dieses Verfahren zu beginnen, das Zellpräparat auftauen und in Puffer zum Zelllysis im Verhältnis von einem zu fünf bezogen auf das Endvolumen resuspendieren. Bei vier Grad Celsius 30 Minuten lang kräftig rühren.

Verwenden Sie einen sauberen Spatel, um Klumpen von der Seite des Bechers zu lösen. Lyse die Zellen mechanisch auf Eis mit einem Mörserhomogenisator. Klären Sie das rohe Lysat durch Zentrifugation bei 18.000 GForce-Einheiten für 30 Minuten bei vier Grad Celsius.

Sammeln Sie den Überstand und bewahren Sie eine kleine Aliquotierung zur Analyse auf, bevor Sie mit der großtechnischen Aufreinigung fortfahren. Bestätigen Sie die großtechnische Proteinausprägung jeder Kultur mittels SDS-Page-Gel-Analyse. Dieses repräsentative SDS-Page-Ergebnis zeigt eine starke Proteinausprägung, eine Löslichkeit von etwa 50 % und eine Spaltung von etwa 50 %.

In diesem Fall wurde der Histidin-Tag zusammen mit einem hinzugefügten Proteinsubtags für Löslichkeit entfernt, der im ursprünglichen Konstrukt eingebaut worden war. Nickelharz wird verwendet, um das Zielprotein mit dem einzigartigen Histamin-Tag von allen anderen zellulären Bestandteilen, einschließlich der nativen bakteriellen Proteine, zu trennen. Eine Nickel-Einsäule wird vorbereitet, indem man mit vier Säulenvolumina UE-Wasser spült, um den Lagerpuffer zu entfernen, gefolgt von einem Säulenvolumen Puffer B und fünf Säulenvolumina Puffer.

Die Parallelisierung der A- für E-Gleichgewichtsherstellung erfolgt mit dem Proteinaufreinigungsgerät, das in der Lage ist, mehrere Säulen gleichzeitig zu betreiben. Laden Sie jedes geklärte Lysat, das das solubilisierte Protein mit Histamin-Tag enthält, in eine separate Säule mit einer Geschwindigkeit von zwei Milliliter pro Minute auf, gefolgt von mehreren Säulenvolumina-Waschschritten mit Puffer A. Sammeln Sie den Durchlauf des Puffers und bewahren Sie ihn zur Analyse auf. Eluieren Sie das gebundene Protein in einer Abfolge von Stufengradienten mit Puffern A und B bei 95 zu 5, 60 zu 40 und schließlich 100 % Puffer B. Die Bestandteile in Puffer B konkurrieren mit Histamin um das Nickelsubstrat und lösen somit das Protein in einem bestimmten Verhältnis von der Säule.

Sammeln Sie jede Elutionsfraktion separat. Hier ist ein repräsentatives Chromatogramm einer Lauf auf einer Nickel-Eins-Säule dargestellt. Analysieren Sie die von der Nickel-Eins-Säule eluierten Fraktionen, das rohe Lysat, das geklärte Lysat und den Durchfluss der Nickel-Eins-Säule mittels SDS-Page und vergleichen Sie dies mit der UV-Absorption bei 280 Nanometern, die während der Säulenchromatographie gesammelt wurde.

Dieser Schritt dient der Überprüfung, ob die Reinigung erfolgreich war. Wählen Sie die Fraktionen aus, die das Zielprotein enthalten, und vereinen Sie sie, um sie der weiteren Verarbeitung zuzuführen. Berechnen Sie die Gesamtmenge an Protein in diesem Stadium unter Verwendung des theoretischen Extinktionskoeffizienten des Proteins, indem Sie die UV-Absorption bei 280 Nanometern messen und das Gesamtvolumen der vereinigten Fraktionen berücksichtigen.

Speichern Sie eine kleine Probe zur Analyse. Das Gen für das Zielprotein war mit einer spezifischen Sequenz codiert, die von ULP1 als Spaltstelle erkannt wird. Daher führt die Zugabe von ULP1 zur Spaltung zwischen dem Histidin-Tag und dem Protein von Interesse. Um dieses Verfahren zu beginnen, geben Sie einen Mikroliter Ubiquitin-ähnlicher Protease pro fünf Milligramm Protein in den gepoolten Fraktionen hinzu.

Zu diesem Zeitpunkt wird das gespaltene Protein mithilfe von Dialysefolie von Puffer B in Puffer A überführt, um es weiterzuverarbeiten; dialysieren Sie das Protein gegen zwei Liter Puffer A für vier Stunden bei vier Grad Celsius unter Rühren. Verwenden Sie nach der Dialyse einen Molekulargewichts-Cutoff von 10 Kilodalton für PB zwei. Führen Sie eine weitere SDS-Page-Gel-Elektrophorese des Zielproteins mit und ohne ULP eins durch.

Dies dient dazu, festzustellen, ob die Spaltung durch ULP1 erfolgreich war, und ermöglicht die Auswahl der besten Fraktionen für die weitere Verarbeitung. Gezeigt sind hier repräsentative SDS-Page-Ergebnisse für drei Konstrukte der Polymerase PB. In Lane eins befinden sich zwei molekulargewichtsmarkierende Untereinheiten.

Die Spuren zwei, sechs und zehn enthalten gepoolte Proteine aus Nickel-Eins-Säulen. Die Spuren drei, sieben und elf enthalten das Durchflussvolumen des gespaltenen Proteins in Puffer A aus Nickel zwei sowie die Spuren vier, acht und zwölf. Sie zeigen die Entfernung des Histamin-Tags in Puffer B aus Nickel zwei.

Nach dem Entfernen des Histamins werden die gepoolten Fraktionen aus Nickel zwei konzentriert. Um die Größenausschlusschromatographie (SEC) zu beginnen, muss erneut das geeignete Harz basierend auf dem Molekulargewicht des Zielmoleküls ausgewählt werden. In diesem Fall wird eine Superose S 110 30 GL-Säule verwendet und mit 200 Milliliter SEC-Puffer bei einer Flussrate von 0,5 Milliliter pro Minute äquilibriert. Geben Sie die Probe mit einer 5-Milliliter-Spritze in eine 10-Milliliter-Probeschleife auf und starten Sie den SEC-Säulendurchlauf. Überwachen Sie das UV-Absorptionschromatogramm bei 280 Nanometern, während Sie kleine Fraktionen sammeln.

Führen Sie alle relevanten SEC-Fraktionen über SDS-Gelelektrophorese durch. Die Standardmethode für Protein-Kristallisationsversuche erfolgt nach der Sitting-Drop-Methode unter Verwendung der Dampfdiffusion. Es ist nicht unüblich, zu Beginn für jedes Zielprotein zwei oder mehr Sparse-Matrix-Screens anzusetzen.

Um diesen Prozess zu beginnen, füllen Sie jedes Reservoir einer 96-Loch-Kompakt-Juvenile-Kristallisationsplatte mit jeweils 80 µL jeder Bedingung im ausgewählten Kristallisations-Screen. Geben Sie 0,4 µL Protein in SEC-Puffer in jedes der 96 Löcher. Fügen Sie anschließend 0,4 µL des Kristallisations-Screens hinzu und sorgen Sie für eine vollständige Durchmischung des Tropfens in jedem Loch. Verschließen Sie die gesamte Platte mit kristallklarem Deckfolienband, wobei sichergestellt werden muss, dass jedes Loch vollständig abgedichtet ist. Lagern Sie die Platte bei 16 °C an einem ruhigen Ort, der frei von Umgebungserschütterungen ist.

Überprüfen Sie in den nächsten Wochen regelmäßig unter einem Stereomikroskop auf Protein-Kristallisation. Sollten keine Protein-Kristalle erscheinen, setzen Sie neue Platten mit unterschiedlichen Bedingungen an und variieren Sie die Proteinkonzentration im Endtropfen, um die Erfolgschancen vor der Ernte zu erhöhen. Kühlen Sie einen A LS-Style-Puck in einem Dewar mit flüssigem Stickstoff ab und verschließen Sie ihn mit einem Deckel, um mit der Ernte zu beginnen.

Schneiden Sie das durchsichtige Klebeband, das die Vertiefung mit dem Zielprotein-Kristall bedeckt, vorsichtig an einer benachbarten leeren Vertiefung an. Geben Sie 1,6 µL der entsprechenden Kristallisationsbedingung hinzu und mischen Sie sie mit 0,4 µL Ethylenglykol. Eine Lösung mit 20 % Ethylenglykol in der Kristallisationsbedingung schützt den Protein-Kristall.

Während des Kryo-Einfrierens analysieren Sie den Kristall unter dem Mikroskop und wählen einen geeigneten Kryo-Loop zum Ernten aus, wobei der Innendurchmesser des Loops der maximalen Breite des Kristalls angepasst wird. Befestigen Sie den Kryo-Loop an einem magnetischen Kristallstab und entnehmen Sie den Kristall direkt aus der Brühe. Tauchen Sie den Kryo-Loop mit dem geernteten Kristall unmittelbar in ein Kryoschutzmittel und anschließend in eine LS-Style-Puck.

Zum Flashen frieren Sie die Kristallwiederholung für eine gewünschte Anzahl von Kristallen ein. Sobald die Ernte abgeschlossen ist, verwenden Sie einen Puck-Stock, um einen magnetischen Deckel auf den Puck mit den flashgefrorenen Kristallen mit gebogenen Zungen zu setzen. Drehen Sie den Puck für den nächsten Schritt auf den Kopf.

Schrauben Sie einen Puck-Pusher auf den Puck und übertragen Sie den Puck dann auf den KU-Aktor-Doer, um damit den Deckel auszustanzen. Die Kristalle im Puck verbleiben bis zur Durchführung von Röntgenbeugungsuntersuchungen mit der J-Director-Bildakquisitionssoftware in flüssigem Stickstoff gefroren. Richten Sie die folgenden Parameter für die Kristallscreening-Messblende ein: 0,5 Grad, Detektorabstand 50 Millimeter, Bildschritt 70 Grad und Belichtungsdauer 30 Sekunden.

Hier ist ein Beispiel-Screenshot der Bildakquisitionssoftware während ein Kristall untersucht wird. Das mittlere Feld zeigt die beobachtete Röntgenbeugung von einem repräsentativen Kristall, wobei ausreichend Bilder mit hoher Auflösung für einen vollständigen Datensatz aufgenommen werden, der für die dreidimensionale Strukturbestimmung erforderlich ist. Die in diesem Video gezeigten Klonierungs- und Proteinreinigungsstrategien führten zu 14 gereinigten PB2-Proben, von denen neun Kristalle hervorbrachten, die für Beugungsstudien geeignet waren. Der hauseigene Röntgenbeugungsdatensatz wurde an fünf der neun Konstrukte mit QKα-Strahlung unter Verwendung eines Rigaku Super Bright FRE plus Rotationsanoden-Röntgengenerators, ausgestattet mit Ossec Variax HF-HF-Optik und einem Saturn 944 plus CCD-Detektor, aufgenommen.

Ein Röntgenbeugungsbild der Polymerase-PB2-Untereinheit wird hier gezeigt. Jeder Datensatz wurde verarbeitet, und insgesamt wurden vier Strukturen der PB2-Untereinheit bestimmt. Jede Struktur wurde von Fachkollegen begutachtet und zur öffentlichen Einsichtnahme in die Proteinstrukturdatenbank hochgeladen.

Diese Abbildung zeigt Banddarstellungen der Moleküle in der kristallographischen asymmetrischen Einheit. Bei den vier PB2-Strukturen sind die Sekundärstrukturen in einem Regenbogenmuster mit den entsprechenden PDB-Codes eingefärbt. In dieser Tabelle ist die Ergebnisanalyse für die Influenza-PB2-Ziele mittels der in diesem Videoartikel beschriebenen Methoden dargestellt.

Die Multitarget-Parallelverarbeitungspipeline zur Bestimmung der Struktur auf Basis von Genen wird in fünf Schritten veranschaulicht: Klonierung, Löslichkeit, Reinigung, Kristallisation und Strukturbestimmung. Die Ergebnisse unserer Strukturbiologie-Pipeline liefern nicht nur die Grundlage für strukturbasierte Forschung, sondern fließen auch in zusätzliche Untersuchungen ein, wie funktionelle Assays zur Bestätigung der Proteinfunktion oder biophysikalische Tests neuartiger Verbindungen mittels MAR oder SPR, um neue Ansatzpunkte für die Arzneimittelentwicklung zu identifizieren. Diese Methode sowie die damit entwickelten Werkzeuge haben Strukturbiologen dabei unterstützt, zahlreiche entdeckungsorientierte Forschungsansätze zu verfolgen, darunter die strukturbasierte Arzneimittelentwicklung, die einen erheblichen Einfluss auf die menschliche Gesundheit und Krankheiten hatte.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie die parallele Verarbeitung mit mehreren Zielstrukturen den Erfolg der Strukturaufklärung erheblich steigern kann. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit in einem Labor der Strukturbiologie äußerst gefährlich sein kann und stets angemessene Vorsichtsmaßnahmen, wie beispielsweise die Verwendung von PSA, getroffen werden sollten, wenn Laborarbeiten durchgeführt werden.