Die Messung der Antikörper Auswirkungen auf zelluläre Funktion von isolierten Kardiomyozyten

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments besteht darin, kardiotrope Antikörper im Plasma von Patienten mit dilatativer Kardiomyopathie oder anderen Herzerkrankungen mit autoimmuner Grundlage nachzuweisen. Dazu wird zunächst eine Mini-Immunadsorption des Patientenplasmas an Anti-IgG-Sphärosäulen durchgeführt, um Immunglobulin G zu reinigen, was den zweiten Schritt darstellt. Ventrikuläre Kardiomyozyten werden aus erwachsenen Wistar-Ratten isoliert und bilden die zelluläre Grundlage für diesen Bioassay.

Anschließend werden die Kardiomyozyten zur Anheftung an die Kammer-Deckgläser freigegeben und mit URA 2:00 AM gefärbt, um die Beobachtung des intrazellulären Kalziumtransienten während der Kontraktionen zu ermöglichen; danach wird das IgG des Patienten getestet, um dessen Wirkung auf die Kontraktilität der Kardiomyozyten zu untersuchen. Die Ergebnisse zeigen, ob das IgG eines Patienten tropische Antikörper enthält, basierend auf den Veränderungen der Kontraktilität und des Kalziumtransienten in den isolierten Kardiomyozyten. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie standardmäßigen Immunoassays zum Nachweis von Antikörpern liegt darin, dass sie unabhängig von einem spezifischen Antigen ist und es ermöglicht, zwischen stimulierenden und blockierenden Antikörpern zu unterscheiden.

Die Durchführung des Verfahrens erfolgt in Zusammenarbeit mit Google und unter technischer Unterstützung unseres Labors. Beginnen Sie das Verfahren, indem Sie die Mini-Immunoabsorptions-Säulen vorbereiten, indem Sie drei Milliliter Anti-IgG-Sphäros mit zwei Milliliter Patienten-EDTA-Plasma in eine leere Econopak-Säule füllen. Anschließend setzen Sie einen Filter auf die Anti-IgG-Sphäros auf.

Schneiden Sie die untere Spitze der Säule auf und drücken Sie den Filter, um eine Flussrate von etwa einem Tropfen pro Sekunde zu erreichen. Spülen Sie anschließend die Säule dreimal mit einem Plasmavolumen 0,9%iger Natriumchloridlösung. Pipettieren Sie das Plasma in die Säule, sobald es vollständig in das anti-IgG-Spheros eingedrungen ist, und waschen Sie mit dem gleichen Volumen 0,9%iger Natriumchloridlösung. Danach pipettieren Sie ein Plasmavolumen 0,2-molarer Glycinhydrochloridlösung bei pH 2,8 in die Säule und lassen Sie es in das Phos eindringen.

Danach eine weitere Portion Glycin-Hydrochlorid an die Säule geben. Die Durchläufe in einem 15-Milliliter-Röhrchen sammeln und den pH-Wert mit 0,5 molarer Tris-Hydrochlorid-Lösung (pH 8,0) auf 7,3 einstellen, um die Säule zu regenerieren. Nach einer abschließenden Spülung mit zwei Volumina 0,9 %iger Natriumchlorid-Lösung mit drei Plasmavolumina Glycin-Hydrochlorid spülen.

Die Säule kann für die nächste Plasma probe im Einsatz an Kardiomyozyten verwendet werden. Das gesammelte IgG-Fraktion muss gegen Puffer für das Experiment dialysiert werden, indem die IgG-Fraktion zunächst in ein Dialyseröhrchen aus Celluloseester mit einer Molekulargewichts-Cutoff bei 100 Kilodalton gefüllt wird. Anschließend das Röhrchen in ein Liter EB geben und langsam mit einem magnetischen Rührstab bei vier Grad Celsius rühren. Nach acht Stunden das Dialyseröhrchen in drei Liter frisches EB überführen und weitere 20 Stunden bei vier Grad Celsius dialysieren.

Kochen Sie die Probe 30 Minuten lang bei 57 Grad Celsius in einem Wasserbad. Um die Komplementfaktoren zu inaktivieren, bestimmen Sie die gesamte IgG-Konzentration und bereiten Aliquote vor, von denen jedes 330 Mikrogramm IgG enthält. Bereiten Sie in diesem Verfahren einen calciumfreien Isolationspuffer gemäß der beigefügten Publikation vor.

Füllen Sie anschließend 80 Milliliter IB in das obere Reservoir eines thermostatisierten Lanor-Perfusionssystems und halten Sie das Puffermedium bei 37 Grad Celsius, das 30 Minuten lang mit 95 % Sauerstoff und 5 % Kohlendioxid belüftet wird. Lösen Sie etwa 7.000 bis 10.000 Einheiten Kollagenase Typ zwei und 174 Milligramm fettfreies BSA in 20 Milliliter. IB, das 112,5 Mikromolar Calciumchlorid enthält, und stellen Sie den pH-Wert des Isolationspuffers im oberen Reservoir gegebenenfalls ein.

Anästhesieren Sie anschließend eine Wistar-Ratte von 175 bis 200 Gramm mit Thiopental in einer Dosis von 375 Mikrogramm pro Kilogramm, wobei 2.500 IE Heparin zur Thiopentallösung hinzugefügt werden. Nach einer Thorakotomie wird das Herz vorsichtig mit intakter Aortenbogen entfernt und in eiskalte 0,9-prozentige Natriumchloridlösung überführt. Entfernen Sie das Blut und das umgebende Gewebe vom Herzen.

Überführen Sie es anschließend in frisches 0,9 % Natriumchlorid und legen Sie die Aorta frei. Schalten Sie den Flussreduzierer des Langor-Systems ein, um eine Tropfgeschwindigkeit von zwei bis drei Tropfen pro Sekunde zu erreichen. Anschließend befestigen Sie das Herz an der Kanüle.

Spülen Sie es bis zu drei Minuten lang mit einer Flussrate von einem Tropfen pro Sekunde durch, um das verbleibende Blut auszuwaschen. Danach zirkulieren Sie das IB im LOR-System. Entnehmen Sie nun 20 Milliliter Puffer aus dem oberen Reservoir.

Füllen Sie das Reservoir mit der Kollagenase-Lösung und ergänzen Sie so viel Puffer, wie nötig ist, um 80 Milliliter zu erreichen. Danach zirkulieren Sie die Digestionslösung weitere 27 Minuten. Trennen Sie anschließend das Herz von der Kanüle ab.

Entfernen Sie die Vorhöfe und die Aorta und zerkleinern Sie die Ventrikel in kleine Stücke. Lassen Sie die Digestionspufferlösung in das untere Reservoir laufen. Reduzieren Sie das Volumen auf maximal 40 Milliliter, um die zerkleinerten Ventrikel für 10 bis 15 Minuten unter kontinuierlicher Belüftung mit 95 % Sauerstoff und 5 % Kohlendioxid weiter zu verdauen.

Anschließend die Zellsuspension durch ein Sieb mit einer Maschenweite von 200 Mikron in ein 50-Milliliter-Röhrchen filtern. Zum Schluss den Kalziumgehalt der Zellen wiederherstellen, indem die Zellsuspension bei Raumtemperatur zwei Minuten lang mit 40 × g zentrifugiert wird. Die Zellen in 10 Milliliter resuspendieren.

IB mit 200 Mikromolar Calciumchlorid erneut zentrifugieren und die Zellen in 10 Milliliter resuspendieren. IB mit 500 Mikromolar Calciumchlorid. Nach einer abschließenden Zentrifugation die Kardiomyozyten in steril filtriertem EB auf eine Dichte von 50.000 Zellen pro Milliliter resuspendieren.

Bestreichen Sie die Deckgläser in einer Vierlochkammer mit jeweils 10 Mikrogramm Laminin pro Mulde und warten Sie, bis diese vollständig getrocknet sind. Füllen Sie dann je ein Milliliter der Kardiomyozyten-Suspension in jede Mulde. Mit einer Mikropipette mit abgeschnittenem Pipettenspitzenende die Zellen eine Stunde bei Raumtemperatur andocken lassen, verdünnen Sie 10 Mikroliter der Ein-Milligramm-pro-Milliliter-Fura-2-AM-Stammlösung in fünf Milliliter EB und bewahren Sie die Färbelösung im Dunkeln auf.

Als Nächstes entfernen Sie den Puffer und die nicht angehefteten Zellen von den Deckgläsern; pipettieren Sie 0,5 Milliliter der Färbelösung in jedes Gefäß. Inkubieren Sie die Zellen jeweils 10 Minuten unter mäßiger Schütteln. Anschließend entfernen Sie die Färbelösung und waschen die Zellen einmal mit einem Milliliter EB.

Gegeben Sie dann 0,5 Milliliter EB in jedes Loch dieses Verfahrens, platzieren Sie das Deckglas unter ein umgekehrtes Fluoreszenzmikroskop, das an ein System zur Aufzeichnung von Kalzium und Kontraktilität von Myozyten angeschlossen ist. Positionieren Sie eine speziell angefertigte Elektrode mit einer Influx- und Influx-Röhre im ersten Loch und darüber. Verschmelzen Sie die Kardiomyozyten mit einem Milliliter pro Minute EB.

Beginnen Sie die elektrische Stimulation bei 20 Volt, einem Hertz und einer Dauer von fünf Millisekunden pro Impuls, und lassen Sie die Zellen sich etwa zwei Minuten lang an die Stimulation anpassen. Wählen Sie eine intakte stabförmige Kardiomyozyte mit klarer Streifung und konstanter Kontraktion aus und positionieren Sie sie mittig im Sichtfeld. Öffnen Sie dann den Kamerakanal und richten Sie die Zelle horizontal im Videobereich aus, indem Sie den Zellhalterungsadapter drehen und den Mikroskoptisch bewegen.

Passt die Grenze der Erkennungssteuerelemente des Video-Bereichs an. Schaltet den fluoreszierenden Kanal ein und zeichnet 10 bis 15 Kontraktionen auf, um die anfängliche Zellverkürzung und den Kalzium-Transienten zu erhalten. Danach schaltet den Mikroskop-Lichtkanal aus, um eine Ausbleichung des fluoreszierenden Farbstoffs zu vermeiden.

Schalten Sie den Durchfluss mit einem Dreiwegventil von EB auf die Probenbypassleitung um und fusionieren Sie die Kardiomyozyten mit einem Milliliter Patienten-IgG. Stoppen Sie die Pumpe kurz bevor Luft das Gefäß erreicht, schalten Sie den Lichtkanal ein und nehmen Sie weitere 10 bis 15 Kontraktionen auf, um die akute Zellantwort zu erhalten. Pausieren Sie dann die Aufnahme und schalten Sie den Lichtkanal erneut aus. Wiederholen Sie die Aufnahmen nach zwei und fünf Minuten und ziehen Sie die Elektrode aus dem Gefäß, wenn die Aufnahmen am Ende abgeschlossen sind. Analysieren Sie die Zellverkürzung und den Kalziumtransienten mit der Ion-Wizard-Software, und zwar unter Verwendung des Kantenlängen-Schrägstrich-Längen-Fensters bzw. des URA-2-numerisch-subtrahierten-Schrägstrich-Verhältnis-Fensters.

Berechnen Sie anschließend die prozentualen Änderungen für die akute, die zwei- und die fünfminütige Reaktion bezogen auf die anfängliche Zellverkürzung und die maximale Höhe des Kalziumtransienten. Hier sehen Sie ein repräsentatives Beispiel der Kontrollmessung. Zellverkürzung und Kalziumtransient wurden online vor der Überströmung mit IgG sowie unmittelbar zwei Minuten und fünf Minuten nach der Überströmung mit IgG überwacht.

Und hier ist ein Beispiel der Messung einer IgG-Probe, die kardiodepressive Antikörper enthält. Die Zellverkürzung und der Kalziumtransient wurden online vor der Überströmung mit IgG sowie unmittelbar zwei Minuten und fünf Minuten nach der Überströmung mit IgG gemessen. Nachdem Sie dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man kardiotrope Antikörper im Plasma von Patienten detektieren kann, indem man den Effekt isolierter IgG auf die Zellverkürzung und den Kalziumtransienten isolierter adulter roter Kardiomyozyten misst.