Voltage-sensitive Dye Aufnahme von Axonen, Dendriten und dendritischen Spines einzelner Neuronen in Hirnschnitten

Das übergeordnete Ziel der beschriebenen Experimente besteht darin, die Integration von Membranpotentialsignalen und die Informationsverarbeitung durch eine einzelne Nervenzelle optisch mit submikrometer- und submillisekunden-Auflösung an mehreren Stellen eines Neurons zu überwachen. Dies wird erreicht, indem zunächst ein Bildgebungsaufbau mit ausreichender Empfindlichkeit aufgebaut wird, um die Aufzeichnung kleiner relativer Änderungen der Lichtintensität zu ermöglichen, die dem transienten Membranpotential entsprechen. Anschließend werden Neurone mit geeigneter Anatomie ausgewählt, um eine effektive Bildgebung von Neuronen mit langen, intakten Fortsätzen in einer einzigen Fokusebene nahe der Schnittfläche zu gewährleisten.

Dann laden Sie die vorab ausgewählten Neuronen mit spannungsabhängigen Farbstoffen, um optisch die Änderungen des Membranpotentials verfolgen zu können. Die Ergebnisse zeigen die einzigartige Fähigkeit dieses Ansatzes, Informationen über die Integration elektrischer Signale durch einzelne Nervenzellen zu gewinnen, indem Membranpotentialsignale von Axonen, Dendriten und dendritischen Dornen überwacht werden. In der zellulären Neurophysiologie.

Neue Werkzeuge werden entwickelt, um die beiden langjährigen Einschränkungen der herkömmlichen Elektrophysiologie zu überwinden: die geringe räumliche Auflösung der Elektrodenmessungen und die Unfähigkeit, von kleinen Strukturen wie Axonkollateralen oder dendritischen Dornen aufzuzeichnen. Um diese Nachteile zu beheben, kann die Patch-Elektroden-Methode mit optischen Techniken kombiniert werden, die parallele Ableitungen von allen Teilen eines Neurons ermöglichen. Hier beschreiben wir eine solche Technik: die mehrseitige optische Aufzeichnung von Membranpotentialtransienten mit Auflösung einzelner Dornen.

In diesem Experiment wird ein aufrechter Mikroskop und drei Kameras verwendet, um eine gleichmäßige Beleuchtung einzustellen. Zuerst wird ein geeigneter Neutraldichtefilter in den Laserstrahlengang eingesetzt. Anschließend wird das Objektiv auf die Oberfläche des standardmäßigen fluoreszierenden Objektträgers fokussiert.

Während Sie das CCD-Bild des Sichtfeldes auf dem Bildschirm beobachten, justieren Sie die Position des Empfängerendes des Quarz-Lichtwellenleiters und die Position des Ausgangsendes des Lichtwellenleiters mithilfe geeigneter Stellglieder am Epi-Fluoreszenz-Kondensor, um eine zentrierte und gleichmäßige Ausleuchtung des Sichtfeldes zu erreichen. Um das Schwingungsrauschen zu bestimmen, verwenden Sie eine Standard-Fluoreszenzplatte mit einer nicht fluoreszierenden Markierung auf der Oberfläche. Nehmen Sie die Lichtintensität mit dem Neuro-CCD im Dauerbetrieb auf.

Fokussieren Sie das Objektiv auf eine dunkle Kante der schwarzen Markierung und nehmen Sie etwa 100 Millisekunden lang die Lichtintensität mit einer Bildrate von zwei Kilohertz auf. Zeigen Sie dann den räumlichen Mittelwert der relativen Lichtintensitätsverläufe von ungefähr 20 Pixeln, die Licht aus dem gleichmäßig beleuchteten Bereich empfangen, und von ungefähr 20 Pixeln entlang der Kante der schwarzen Markierung an. Das zusätzliche Rauschen im räumlichen Mittelwert der Pixel mit hochkontrastigen Kanten spiegelt das Vibrationsrauschen im System wider.

Es ist unerlässlich, den mechanischen Verschluss außerhalb des vibrationsisolierten Tisches zu montieren, damit das Öffnen des Verschlusses keine Vibrationsgeräusche in die optische Aufzeichnung einführt. Dies ist ein entscheidender Schritt. Befestigen Sie den Verschluss mit Kunststoffschrauben und vibrationsisoliendem Material, um akustische Vibrationsgeräusche zu reduzieren, die vom optischen Aufzeichnungssystem aufgefangen werden können.

Um die Vibrationen zu isolieren, justieren Sie den Schwingungsisolationstisch, bis das Vibrationsrauschen der Pixel, die den scharfen Bildrand abdecken, kleiner ist als das Schrottrauschen. Die Kabel der Geräte auf dem Tisch müssen locker verlegt sein, um die Übertragung mechanischer Vibrationen auf das Mikroskop zu vermeiden. Bereiten Sie in diesem Verfahren Gehirnschnitte mit einer Dicke von 300 bis 400 Mikron gemäß Standardverfahren vor, unter Verwendung einer Mauslinie, die EGFP in einzelnen, interessierenden Nervenzellen mit einem Spinning-Disk-Konfokalsystem exprimiert.

Visualisieren Sie die EGFP-markierten Neuronen im Schnitt. Wählen Sie anschließend Neuronen mit intakten dendritischen und axonalen Bäumen sowie mit Prozessen, die parallel und nahe an der Schnittoberfläche verlaufen, für die Abbildung des Membranpotentials aus. Füllen Sie dann eine Glas-Patch-Pipette von der Spitze aus mit einer farbstofffreien intrazellulären Lösung bis zu zwei Dritteln der Elektrodenverjüngung, indem Sie etwa 15 Sekunden lang Unterdruck anlegen.

Danach füllen Sie die Elektrode mit der Lösung auf, die den spannungsabhängigen Farbstoff für die Membran-IMP-Permeation enthält, der in der intrazellulären Lösung gelöst ist. Patchen Sie nun innerhalb einer Minute nach dem Befüllen der Elektrode mit dem Farbstoff ein zuvor ausgewähltes Neuron. Geben Sie einen geringen positiven Druck von etwa 10 Millimeter Quecksilber an, bevor die Pipette in das Bad abgesenkt wird, und halten Sie diesen während der Positionierung der Elektrode im Schnitt bei, um sicherzustellen, dass kein Farbstoff aus der Elektrode austritt, bevor die Dichtung gebildet ist.

Erhöhen Sie den Druck auf etwa 100 Millimeter Quecksilber kurz vor dem Kontakt der Elektrode mit der Zelloberfläche. Um die Dichtung in der Ganzzell-Konfiguration herzustellen, ermöglichen Sie eine freie Diffusion des Farbstoffs von einer somatischen Patch-Pipette zum Soma für 20 bis 45 Minuten. Überwachen Sie während der Farbstoffdiffusion den physiologischen Zustand des Neurons durch Aufzeichnung der ausgelösten Aktionspotentiale im Stromklemm-Modus.

Überwachen Sie zusätzlich die Färbemenge, indem Sie die Ruheleuchtdichte vom Zellkörper mit einer Bildfrequenz von zwei Kilohertz und bei einem Bruchteil der vollen Lichtintensität, die mit Neutrale-Dichtefiltern eingestellt wird, aufzeichnen. Setzen Sie den Downloadvorgang fort, bis sich das Aktionspotential zu verbreitern beginnt. Am Ende der Färbung ziehen Sie die Patch-Pipette vorsichtig in der Spannungs-Klemm-Konfiguration vom Soma weg, um sicherzustellen, dass im Prozess der Übergang von der Ganz-Zelle- zur Outside-Out-Patch-Konfiguration erreicht wird.

Sodann inkubieren Sie den Schnitt für weitere 1,5 bis zwei Stunden bei Raumtemperatur, damit sich der spannungsensitive Farbstoff in den neuronalen Fortsätzen ausbreiten kann. Nachdem eine signifikante Menge des Farbstoffs vom Soma in die dendritischen und axonalen Fortsätze diffundiert ist, sollte die Wellenform des Aktionspotentials vollständig wiederhergestellt sein. Im nächsten Schritt lokalisieren Sie das Soma des angefärbten Neurons unter schwacher Fluoreszenzbeleuchtung.

Reduzieren Sie die Lichtintensität mit Neutraldichtefiltern auf das Minimum, das erforderlich ist, um das Objekt von Interesse mithilfe eines XY-Bühnenscans zu visualisieren. Scannen Sie den Bereich des Schnitts, der das fluoreszierende Neuron enthält, bis der fluoreszierende Soma identifiziert ist. Positionieren Sie den Soma der gefärbten Zelle in der Mitte des Mikroskopfelds. Patchen Sie das Neuron mit einer Standard-Patch-Elektrode ohne Farbstoff unter Verwendung von DIC. Visualisieren Sie anschließend die neuronalen Prozesse unter schwacher Fluoreszenz mit einer Bildrate von 10 bis 40 Hertz im kontinuierlichen Aufnahmemodus der CCD für die Spannungsbildgebung.

Positionieren Sie mithilfe einer XY-Bühnenposition den neuronalen Fortsatz von Interesse in der Mitte des Abbildungsbereichs. Schützen Sie außerdem das SOMA vor dem Anregungslicht, indem Sie die Blende der Feldblende des Mikroskops teilweise schließen, um photodynamische Schäden zu reduzieren. Nehmen Sie anschließend die optischen Signale auf, die mit rückwärts propagierenden Aktionspotentialen in den einzelnen dendritischen Ästen verbunden sind.

Zeichnen Sie dann die den Aktionspotentialen im Axon zugeordneten optischen Signale auf. Danach erfassen Sie die den rückwärts propagierenden Aktionspotentialen in den dendritischen Dornen zugeordneten optischen Signale. Verwenden Sie die geeignete Bildwiederholfrequenz für eine genaue Rekonstruktion der Signalwellenform.

Gleichzeitig sollten die Aufzeichnungszeiten und die Belichtung mit intensivem Anregungslicht so kurz wie möglich gehalten werden, um eine Verbleichung des Farbstoffs und photodynamische Schäden zu minimieren. Die Aufzeichnung optischer Signale wird hier gezeigt. Das obere Feld zeigt das hochauflösende konfokale Bild eines gefärbten Neurons mit seinem Axon in der Aufzeichnungsposition.

Während das mittlere Feld das Fluoreszenzbild des Axons mit niedriger räumlicher Auflösung zeigt, das mittels CCD für die Abbildung des Membranpotentials aufgenommen wurde, präsentiert das untere Feld die Elektrodenableitungen vom Soma sowie die optischen Ableitungen vom A IS und dem Ranvierschen Knoten. Die Rohdaten und verarbeiteten Signale werden dargestellt. Diese Abbildung zeigt die Aktionspotentialsignale aus dem Axon eines kortikalen L-fünf-Neurons, das mit dem spannungsabhängigen Farbstoff Action beladen wurde.

Mögliche verwandte Signale wurden mit einer Bildrate von 10 Kilohertz aufgezeichnet. Diese Spuren zeigen den Aktionspotential-Transienten von drei Standorten. Erstens die Elektrode, die vom Soma aufzeichnet.

Zwei, die optischen Aufnahmen vom Axonhügel, und drei, die optische Aufnahme vom ersten Knotenpunkt des Vieu; hier sind die überlagerten Signale aus denselben drei Positionen. Diese Abbildung zeigt einen Ausbruch von vier rückwärts propagierenden Aktionspotentialsignalen aus mehreren Stellen am dendritischen Baum eines kortikalen L5-Neurons, ausgelöst durch kurze depolarisierende Stromimpulse bei 100 Hz. Dargestellt sind hier die Aktionspotentialsignale von einer einzelnen dendritischen Dornfortsatz.

Hier ist die anatomische Rekonstruktion, die aus einem Stapel von Spinning-Disk-Konfokalbildern gewonnen wurde, und hier ist das Fluoreszenzbild derselben Region, aufgenommen mit der CCD-Kamera. Für die Abbildung des Membranpotentials werden im rechten Panel die Fluoreszenzintensitätsverläufe gezeigt, die rückwärts propagierende Aktionspotentiale von den auf dem CCD-Bild markierten Positionen eins bis drei entsprechen. Die unterste Spur zeigt die Elektrodenableitung vom Soma an.

Die Vorbereitung vor der Aufnahme dauert etwa drei Stunden, einschließlich der Wartezeit für die Ausbreitung der Würfel auf die distalen Prozesse. Die Aufnahmedauer ist begrenzt durch das normale Absinken der Präparation und durch photodynamische Schäden am PO. Die Menge an photodynamischem Schaden ist proportional zur Intensität des Anregungslichts sowie zur Dauer und Anzahl der einzelnen Aufnahmedurchgänge.

In einigen Experimenten ist es möglich, über einen Zeitraum von ein oder zwei Stunden hinweg mehr als 50 Aufnahmen durchzuführen. Andere Messungen erfordern starke Anregung, hohe Lichtintensitäten und längere Aufnahmedauern und sind durch photodynamische Schäden auf nur wenige Aufnahmen begrenzt. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man Spannungsableitungen von der gesamten axonalen und endständigen Struktur einzelner Neuronen in Gehirnschnitten durchführt.