Substrat Generation für Endonukleasen der CRISPR / Cas-Systeme

Das übergeordnete Ziel der folgenden Experimente besteht darin, RNA-Substrate für die Untersuchung von Cas-Endonukleasen zu erzeugen, die entscheidende Rollen in den CRISPR-Cas-Immunsystemen spielen, die bei Bakterien und Archaea vorkommen, um RNA-Substrate für die Cas-Endonuklease zu erhalten. Die PCR-Amplifikation eines spezifischen CRISPR-Bereichs kann verwendet werden, um eine lange DNA-Vorlage für die in-vitro-RNA-Produktion zu erhalten. Falls gewünscht.

Zwei Oligonukleotide können zusammengeführt werden, um kürzere Vorlagen für die Herstellung von Substrat-RNA zu erzeugen. Alternativ können kurze, maßgeschneidert synthetisierte Wiederholungssequenzen anschließend in CAS-Endonuklease-Assays getestet werden. Letztendlich lässt sich die Herstellung von RNA-Transkripten und die anschließende Spaltung durch die CAS-sechs-Endonuklease mittels Autoradiographie sichtbar machen.

Das Hauptziel der Presenter-Techniken besteht darin, Forschern die Untersuchung der CRISPR-RNA-Prozessierung mit RNA-Substraten unterschiedlicher Länge zu ermöglichen. Daher werden verschiedene Methoden zur Erzeugung kleiner RNAs eingesetzt, beispielsweise einzelne Wiederholungselemente oder größere RNAs wie crispr-RNA-Transkripte, die mehrere Spacer umfassen. Obwohl diese Methoden gezielt Einblicke in die Reifung von CRISPR-RNAs ermöglichen, können ähnliche Strategien zur Vorlagepräparation auch auf andere RNA-Verarbeitungssysteme übertragen werden. Die Demonstration des Verfahrens erfolgt durch Muted Surface, eine Doktorandin, und Repl, einen Postdoktoranden, beide aus einem Labor für bakterielle und archaeelle CRISPR-Immunsysteme.

Eine virale DNA-Sequenz, die als Protospacer bezeichnet wird, kann zwischen zwei Wiederholungselementen in einem wachsenden CRISPR-Cluster in einem Prozess namens Adaptation eingefügt werden. Anschließend wird der gesamte CRISPR-Cluster transkribiert und dann durch eine Cas-Endonuklease, beispielsweise Cas6, zu kleinen CRISPR-RNAs verarbeitet. Die kleinen CRISPR-RNAs werden daraufhin in den CAS-Proteinkomplex-Cascade eingebaut und vermitteln die Wirtsabwehr gegen einen erneuten viralen Angriff, wobei die Basenkomplementarität zwischen der CRISPR-RNA und dem Protospacer als Signal für den Abbau der viralen DNA dient, um lange Vorstufen von CRISPR-RNA-Substraten zu erzeugen.

Beginnen Sie mit dem Design von PCR-Primern, die auf die Spacer-Regionen eines CRISPR-Clusters abzielen, indem Sie die T-sieben-RNA-Polymerase-Promotorsequenz dem vorwärts gerichteten Primer hinzufügen. Fügen Sie anschließend Restriktionsstellen an beide Primer hinzu, um das PCR-Produkt in einen Vektor klonen zu können. Beachten Sie, dass die T-sieben-RNA-Polymerase eine I-Guanin-Base für die korrekte Initiation der Transkription benötigt, nachdem die gewünschte prä-CRISPR-RNA-Sequenz mittels PCR aus der genomischen DNA amplifiziert wurde.

Trennen Sie die PCR-Produkte mittels Agarose-Gelelektrophorese und isolieren Sie das gewünschte Band aus dem Gel. Verdauen Sie anschließend das PCR-Produkt mit Restriktionsenzymen, um klebrige Enden zu erzeugen. Danach reinigen Sie das PCR-Produkt mit einem PCR-Reinigungs-Kit, um eventuelle Spaltungsnebenprodukte zu entfernen, und geben T4-DNA-Ligase, T4-DNA-Ligase-Puffer sowie ein molares Verhältnis von drei zu eins des gespaltenen PCR-Produkts zum DFOs4-verwandten Vektor mit den entsprechenden klebrigen Enden hinzu. Inkubieren Sie nun die Ligationsreaktion über Nacht bei 16 Grad Celsius und transformieren Sie danach das Gemisch mittels Standardprotokollen in kompetente E. coli-DH5α-Zellen, wobei mittels Blau-Weiß-Screening erfolgreiche Ligationen identifiziert werden.

Isolieren Sie abschließend die Plasmide aus den weißen Kolonien mithilfe eines Plasmidpräparationskits und identifizieren Sie positive Klone durch Plasmidsequenzierung, um vorläufige, mittelgroße prä-CRISPR-RNA-Substrate zu erzeugen. Beginnen Sie damit, Vorwärts- und Rückwärts-Oligonukleotide mit der gewünschten CRISPR-Wiederholungssequenz zu entwerfen, die den hier gezeigten Sequenzen ähnlich ist. Beachten Sie, dass die Oligonukleotide die Sequenz eines T7-RNA-Polymerase-Promotors sowie terminale Restriktionsstellen enthalten, die nach der Terminierung der Oligonukleotide sicherstellen, dass klebrige Enden entstehen.

Nachdem die Proben im Knie stehend mit T4-Polynukleotidkinase und T4-Polynukleotidkinase-Puffer eine Stunde lang bei 37 Grad Celsius inkubiert wurden, um die 5′-Phosphorylierung eines Anilons jedes Oligonukleotids durchzuführen. Anschließend werden die phosphorylierten vorwärts- und rückwärtsgerichteten Oligonukleotide fünf Minuten lang bei 95 Grad Celsius auf einem Heizblock mit T4-DNA-Ligase-Puffer inkubiert. Nachdem die Proben hybridisiert haben, schalten Sie die Wärmequelle aus und lassen Sie das Gemisch etwa zwei bis drei Stunden abkühlen, bis sie Raumtemperatur erreichen.

Ligieren Sie nun die synthetisierten Oligonukleotide mit einer Hybridisierungsmischung, die mit P-Vektor T vier DNA-Ligase-Puffer und einem TP bei 16 Grad Celsius über Nacht digeriert und dephosphoryliert wurde. Transformieren Sie anschließend die ligierten Plasmide mittels standardisierter Protokolle in kompetente E. coli-DH-fünf-alpha-Zellen, wobei zur Identifizierung erfolgreicher Ligationen ein Blau-Weiß-Screening durchgeführt wird. Isolieren Sie abschließend die Plasmide und identifizieren Sie die positiven Klone durch Verdauung und anschließende Plasmidsequenzierung.

Kurze einzelne Wiederholungs-cas-RNA-Substratsequenzen können ähnlich wie die hier gezeigten entworfen werden. Stellen Sie sicher, dass ein Desoxyribonukleotid enthalten ist. Falls die Spaltstelle der RNA bestimmt werden soll, kann anschließend eine spezialisierte Synthesefazilität zur Herstellung des RNA-Oligonukleotids herangezogen werden.

Nach der Isolierung der Plasmide mit dem gewünschten, angepassten Substrat linearisieren Sie die Plasmide mithilfe des Restriktionsenzyms, das stromabwärts der geklonten Fragmente schneidet, unter Verwendung eines Maxi-Präp-Plasmidreinigungs-Kits. Danach, nach Überprüfung des vollständigen Verdauens, reinigen Sie das linearisierte Plasmid durch Phenol-Chloroform-Extraktion und Ethanolfällung. Gewinnen Sie die Nukleinsäuren durch Resuspension des Pellets in DEPC-behandeltem sterilem Wasser zurück.

Incubieren Sie nun die Verdauungsplasmide drei Stunden lang bei 37 Grad Celsius in einer frisch zubereiteten In-vitro-T7-RNA-Polymerase-Rundlauftranskriptionsmischung, die ATP, CTP, GTP und UTP enthält. Analysieren Sie anschließend die erhaltenen RNA-Transkripte in einem denaturierenden achtmolaren Harnstoff-12%-Polyacrylamidgel. Es ist außerdem möglich, die Transkripte über eine Mono-Q-Anionenaustauschchromatographie zu reinigen und anschließend durch Ethanolpräzipitation der RNA-Fraktionen wiederzugewinnen sowie die Pellets in mit DEPC behandeltem sterilen Wasser erneut aufzulösen, um die Designsubstrate mittels Endonuklease-Assays zu analysieren. Beginnen Sie dazu mit der Visualisierung der Substratbänder mittels Autoradiographie und reinigen Sie die Reaktionsprodukte durch Gelextraktion aus einem denaturierenden achtmolaren Harnstoff.

12 % Polyacrylamidgel, anschließend produzieren und reinigen Sie das gewünschte rekombinante Cas-Protein über Hitzefällung und Nickel-NTA-Chromatographie, wie hier für das CAS6-Protein aus Clostridium thermocellum gezeigt. Danach mischen Sie das Cas-Protein mit einer frisch hergestellten Endonuklease-Reaktionsmischung und inkubieren 30 Minuten bei 37 Grad Celsius, um die Endonuklease-Assay-Reaktion zu ermöglichen. Schließlich laden Sie fünf Mikroliter der Reaktionsmischung auf ein acht molares Harnstoffgel auf.

12 % Polyacrylamidgel und Visualisierung der Spaltprodukte nach Elektrophorese mittels Autoradiographie. Hier ist ein mit Hine-Blau gefärbtes Polyacrylamidgel eines kundenspezifisch entworfenen RNA-Oligonukleotids sowie zweier in-vitro-RNA-Transkripte dargestellt. Beachten Sie, dass die Effizienz der RNA-Produktion zwischen den kurzen, langen und mittellangen Konstrukten variiert.

Die Untersuchung der RNA-Endonuklease-Aktivität erfordert positive und negative Kontrollen sowie hochreine rekombinante Cas-Proteine. In dieser Abbildung: Ein SDS-PAGE-Gel einer CAS6-Probenpräparation aus Clostridium thermocellum.

Nach der Wärmepräzipitation und Nickel-NTA-Chromatographie, die parallel zu einem Standard-Proteinkalibrator durchgeführt wurde, zeigt sich, dass eine geeignete negative Kontrollprobe ein Zelllysat ohne CAS-sechs-Expression enthalten sollte. Nach dem identischen CAS-sechs-Reinigungsverfahren wurde festgestellt, dass die CAS-sechs-Präparation den erforderlichen hohen Reinheitsgrad aufweist. Hier kann der Schnitt einer 5′-terminallabelierten Wiederholungssequenz-Substrat durch das Clostridium-thermocellulolyticum-CAS-sechs-Protein mittels Autoradiographie sichtbar gemacht werden.

Jede Spur enthält radioaktiv markierten Substrat, RNA nach Inkubation mit ca sechs Protein, wie durch die Pluszeichen angegeben, oder mit einem Puffer als negativen Kontrollansatz, wie durch die Minuszeichen gekennzeichnet, lange Substrate oder kurze Substrate mit oder ohne Zugabe des Desoxyribonukleotids. An Position minus neun wurden diese verwendet, um die Endonuklease-Reaktion zu erleichtern. Beachten Sie das Fehlen einer Spaltung der kurzen Substrate, wenn das Desoxyribonukleotid in das RNA-Molekül eingebaut wurde, nach diesem Verfahren.

CAS-sechs-Nukleasen können auch als Werkzeug zur Erzeugung reifer, knapper RNAs verwendet werden. Diese RNAs können in Kaskadenkomplexe eingebaut werden, um Einblicke in die Beteiligung an der Abwehr von Virusangriffen zu gewinnen. Nach dem Anschauen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man CRISPR-es-Substrate für Cas und Nukleasen entwirft und herstellt.

Diese verschiedenen Substrate sind nützlich, um Fragen zur Reifung und Nutzung von CRISPR Es zu beantworten.