Überwachung Plasmid-Replikation in lebenden Säugerzellen über mehrere Generationen durch Fluoreszenz-Mikroskopie

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, die Verteilung viraler Genome in teilenden Zellen zu beobachten. Dies wird erreicht, indem zunächst ein Plasmid hergestellt wird, das mittels Fluoreszenzmikroskopie sichtbar gemacht werden kann. Hier wird ein Plasmid so konstruiert, dass es tandemartig angeordnete Wiederholungen der Lactose-Operatorsequenz oder LAC O enthält. Der zweite Schritt besteht darin, das Plasmid in teilende Zellen einzubringen und diese anschließend mit einem Retrovirus zu infizieren, das den Lactose-Repressor oder lac eye kodiert, das mit einem fluoreszierenden Protein fusioniert ist.

Die Lactose-Repressor-Fusionsproteine binden spezifisch an die Lactose-Operatorsequenzen im Plasmid-Sub. Die Zellen werden mittels Fluoreszenzmikroskopie überwacht, um einzelne Plasmide über mehrere Zellzyklen hinweg zu verfolgen. Schließlich werden die gewonnenen Bilder verarbeitet, um zu bestimmen, wie die viralen Genome in teilenden Zellen erhalten bleiben.

Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie der quantitativen PCR, Southern-Blotting oder der Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung besteht darin, dass mit dieser Technik einzelne Plasmide zu mehreren Zeitpunkten beobachtet werden können. Um die Visualisierung des Plasmids mittels Fluoreszenzmikroskopie zu ermöglichen, werden Standardmethoden der molekularen Klonierung verwendet, um ein DNA-Fragment, das etwa 250 Kopien der Lactose-Operator-Sequenz (LAC O) enthält, in das Plasmid einzubringen. In diesem Beispiel handelt es sich bei dem Plasmid um ein BAC-Konstrukt mit einer Größe von etwa 170 Kilobasenpaaren, das das komplette Genom des mit Kaposisarkom assoziierten Herpesvirus (KSHV) enthält und eine Resistenz gegen Hygromycin vermittelt.

Führen Sie die LAC O enthaltende Plasmid-DNA mittels Transfektion in humane Hela- und SLK-Säugerzellen in 60-Millimeter-Kulturplatten ein, indem Sie die Zellen 4 Stunden mit 10 µg gereinigtem Plasmid-DNA, 25 µL Lipo­fect­a­min™ 2000, 0,5 mL Opti-MEM und 3,5 mL DMEM inkubieren. Ersetzen Sie danach das Medium durch DMEM mit 10 % fetalem Kälberserum und lassen Sie die Zellen 48 Stunden lang regenerieren.

Im Anschluss die transfizierten Zellen in großen Petrischalen bei geringer Dichte plattieren und drei Wochen lang in DMEM mit 10 % fetalem Kälberserum und 300 Mikrogramm pro Milliliter Hygromycin kultivieren, um für das eingeführte Plasmid zu selektieren. Mit Stücken steriler Pipetten und durchtränktem Filterpapier hygromycinresistente Kolonien in neue Kulturschalen überführen. Nach ein bis zwei Wochen die Schalen in den Inkubator stellen, wenn die transfizierten Klone so weit gewachsen sind, dass sie die Schale ausfüllen, DNA isolieren und einer Restriktionsverdauung sowie Southern-Blot-Analyse unterziehen, um sicherzustellen, dass das Polymer des LAC-O-Plasmids homogen und von der erwarteten Größe ist. Dieser beispielhafte Blot zeigt, dass das LAC-O-Polymer in Klon eins homogen ist und mit dem des positiven Kontrollansatzes identisch ist.

In Band sieben, wenn das Plasmid nicht so konstruiert wurde, dass es eine Fusion des Lactose-Repressors Lac Eye exprahiert, infizieren Sie geeignete Klone mit einem Retrovirus, das Lac Eye fusioniert mit einem rot fluoreszierenden Protein wie Lac Eye, TD Tomato kodiert. TD Tomato wird gegenüber Proteinen, die näher am Grünen fluoreszieren, gewählt, um die Phototoxizität zu minimieren, die bei mehrfacher Belichtung über längere Zeiträume auftreten würde. Sobald das Lac-Eye-Fusionsprotein eingeführt ist, kultivieren Sie die Zellen in Gegenwart von 200 Mikrogramm pro Milliliter IPTG, um die Bindung des Fusionsproteins an die DNA zu blockieren. Einer der kritischsten Aspekte dieses Verfahrens ist das Erhalten von Klonen mit der geeigneten Fluoreszenzintensität.

Es sollte eine große Anzahl von Klonen auf optimal fluoreszierende Kulturen untersucht werden. Kultivieren Sie die Zellen mindestens drei Tage lang, um die Expression des LacI-TdTomato-Proteins zu ermöglichen. Untersuchen Sie die Klone auf optimale LacI-TdTomato-Spiegel, die deutliche Signale mit minimalem Hintergrund an ungebundenem Fusionsprotein zeigen. 24 bis 48 Stunden vor der Bildaufnahme säen Sie die LacI-TdTomato-exprimierenden Zellen in eine 35-Millimeter-Glasbodenkulturschale mit einer Dichte von weniger als 10 % Konfluenz aus. Dadurch können einzelne Zellenpaare sich zu Kolonien von acht bis 16 Zellen teilen, ohne sich zu überlappen, was eine Stunde bis drei Stunden vor Beginn der Bildaufnahme gewährleistet.

Spülen Sie die Platte dreimal mit Kulturmedium, das weder selektive Wirkstoffe noch IPTG enthält. Dadurch werden nicht lebensfähige Zellen entfernt und die lac-Auge-Fusionsproteine können an LAC-Zellen in den Plasmiden binden. Ersetzen Sie das Kulturmedium durch zwei Milliliter DMEM mit 10 % fetalem Kälberserum und 25 Millimolar Hippies. Inkubieren Sie für eine bis drei Stunden, kurz vor der Bildaufnahme ersetzen Sie den Deckel der Kulturschale durch eine Kultfolie, die in einem Montagering für eine 35-Millimeter-Schale gespannt ist.

Diese Abdeckung verhindert die Verdunstung des Kulturmediums, wodurch sich sonst die Salzkonzentration im Laufe der Zeit erhöhen und die Zellen abtöten würde. Das in diesem Experiment verwendete Abbildungssystem besteht aus einem umgekehrten Mikroskop Zeiss Axio 200 M, das mit einem motorisierten Probentisch und einer EM-CCD-Kamera zur empfindlichen Detektion von Signalen ausgestattet ist. Das fluoreszente Anregungslicht wird durch die neutrale weiße LED eines Collibra-Systems bereitgestellt.

Das Abbildungssystem wird über eine Software gesteuert, die automatisierte Aufnahmen von Bildern über längere Zeiträume mit mehreren Z-Stapeln ermöglicht. Ein Inkubator für den Objekttisch wird verwendet, um die Zellen bei 37 Grad Celsius und fünf bis 10 % Kohlendioxid in einer befeuchteten Kammer zu halten. Verwenden Sie eine beheizte Hülse für das Öl-Objektiv, um zu verhindern, dass das Objektiv Wärme abzieht.

Die Wärme der Probe ermöglicht es, ausreichend Zeit zu gewähren, damit das System eine stabile Temperatur erreicht. Um Bewegungsartefakte während des Experiments zu minimieren, sollte das Abbildungssystem auf einem Lufttisch stehen, um Vibrationen auszuschließen. Um mit der Prozedur zur Visualisierung markierter DNA zu beginnen, verwenden Sie die DIC-Abbildung, um die Zellen zu betrachten und die Fokusebene der Ober- und Unterseite der Zellen in mehreren Sichtfeldern zu bestimmen. In jedem Feld wechseln Sie zu einer Fokusebene, die ungefähr ein Drittel von der Zellspitze entfernt liegt, und speichern Sie die x-, y-, z-Koordinaten in der Liste der gespeicherten Objekttischpositionen.

Jede dieser gespeicherten Positionen wird der Mittelpunkt eines Z-Stapels von Bildern sein, um die Zelle im Mikroskop-Steuerungssoftware zu erfassen; definieren Sie einen Z-Stapel von Bildern, der an jeder gespeicherten Position des Probentisches durchgeführt werden soll, und legen Sie ausreichend viele Schichten fest, sodass die gesamte Zelle erfasst wird, einschließlich zusätzlicher Schichten oberhalb und unterhalb der Ebenen, in denen sich die Zellen befinden. Wählen Sie eine Z-Schrittgröße von 0,35 bis 0,50 Mikrometern, um eine annähernde Nyquist-Abtastung in Z-Richtung zu ermöglichen. Diese Schichten ermöglichen die Nachverfolgung von Zellbewegungen während des Zellzyklus und werden zudem bei der Nachbearbeitung der Bildstapel verwendet.

Dadurch ergibt sich je nach Dicke der Zellen ein Stapel von 40 bis 60 Bildern. Legen Sie ein Zeitreihen-Experiment fest, um im Abstand von 30 Minuten ein Hellfeldbild der Zacks sowie Fluoreszenzbilder im Abstand von 10 bis 60 Minuten aufzunehmen. Verwenden Sie während des Experiments keine DIC-Bildgebung, da diese mehr Licht erfordert als die Standard-Hellfeldbildgebung, was die Zellen bei langen Experimenten unnötig einer Phototoxizität aussetzen könnte.

Starten Sie das softwaregesteuerte Experiment. Stellen Sie sicher, dass das System während des Experiments nicht gestört wird. Nachdem alle Bilder für das Experiment aufgenommen wurden, überprüfen Sie die Bilder für jeden Zack und jeden Zeitpunkt und beschneiden Sie unnötige Bildbereiche, um die Computer-Verarbeitungszeit zu verkürzen.

Im nächsten Schritt wird die Signalintensität jedem Pixel des Ursprungs in jedem Z-Stack erneut zugeordnet. Verwenden Sie einen Entfaltungs-Algorithmus in der Axio-Vision-Software, der auf der gemessenen Punktverbreiterungsfunktion des Abbildungssystems basiert. Das Ergebnis der Entfaltung ist hier dargestellt.

Untersuchen Sie die Bilder, um die Intensitätsänderungen und Bewegungen der Plasmide während des Zellzyklus sowie die Verteilung der Plasmide auf Tochterzellen zu verfolgen. Diese computergenerierten Bilder, die mehrere Z-Ebenen enthalten, in denen die verschiedenen Signale lokalisiert sind, zeigen, dass die Kerne von HELOC-Zellen, die LAC eye TD Tomato exprimieren, aufgrund des Kernlokalisierungssignals am Fusionsprotein fluoreszieren und dadurch im Kern lokalisiert werden. In Abwesenheit von I-P-T-G-K-S-H-V-Genomen rekrutieren die LAC O-Sequenzen zahlreiche Kopien des fluoreszierenden Proteins und heben sich als helle Signale gegenüber der Hintergrundintensität des Kerns ab.

Im Gegensatz dazu wird in Gegenwart von IPTG die Bindung der LAC-Augen-fluoreszierenden Proteine an ihre Erkennungssequenz lacO verhindert. Maximale Intensitätsprojektionen von Zack, die während eines Zellzyklus zu fünf Zeitpunkten aufgezeichnet wurden, sind in dieser Abbildung dargestellt. Die fluoreszenzmarkierten viralen Genome in der Zelle, sichtbar in Panel A, werden in Panel B gezeigt. Die viralen Genome werden anschließend bei der Zellteilung wie in Panel C, D und E beobachtet auf Tochterzellen verteilt. Der Zellzyklus gesunder HELOC-Zellen dauert etwa 24 Stunden, und Tochterzellen lagern sich typischerweise nahe beieinander an und teilen sich im nächsten Zellzyklus gleichzeitig.

Mithilfe dieses Protokolls können die viralen Genome in der Zelle über mehrere Generationen hinweg verfolgt werden. Während des Durchführens dieses Verfahrens ist es wichtig, die Zellmorphologie im Generationszeitraum zu überwachen, um sicherzustellen, dass die Zellen während des gesamten Experiments gesund bleiben.