Gleichzeitige Intrazelluläre Aufnahme eines Lumbar Motoneuron und dem Force durch seine Motor Unit in der adulten Maus Produziert

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, die elektrophysiologischen und kontraktilen Eigenschaften einer einzelnen motorischen Einheit der Maus zu untersuchen, indem intrazelluläre Ableitungen von Motoneuronen in vivo durchgeführt werden. Dies wird erreicht, indem zunächst das Rückenmark und der betreffende Muskel freigelegt werden. Anschließend wird ein Kraftaufnehmer am Sehnenansatz des Muskels befestigt.

Anschließend wird das Motoneuron mit einer intrazellulären Elektrode stimuliert, wodurch die Kontraktion der aufgezeichneten motorischen Einheit ausgelöst wird. Letztendlich können die elektrophysiologischen Eigenschaften des Motoneurons gleichzeitig mit den kontraktilen Eigenschaften seiner motorischen Einheit charakterisiert werden. Eine visuelle Demonstration dieser Technik ist entscheidend, da die mikrochirurgischen Schritte aufgrund der geringen Größe des Tieres sehr schwer zu erlernen sind.

Um das Verfahren zu beginnen, betäuben Sie eine Maus durch intraperitoneale Injektion von Natriumpentobarbital oder einer Mischung aus Ketamin und Xylazin. Stellen Sie sicher, dass die Maus keinen Zehenquetschreflex zeigt. Schneiden Sie anschließend mit einer stumpfen Schere über der Luftröhre die Haut ein und ziehen Sie sie beidseits auseinander.

Dann zerreißen Sie die Speicheldrüse mit einem Paar stumpfer Pinzette. Um zwei dünne Muskeln, die die Luftröhre bedecken, freizulegen, trennen Sie die beiden Muskeln, um die Luftröhre sichtbar zu machen. Verwenden Sie ein Paar Dumont-7-Pinzetten.

Schieben Sie zwei Fäden einer vierfachen Aut-Silk-Naht unter die Trachea. Dann führen Sie einen Querschnitt in der Trachea zwischen zwei knorpeligen Ringen durch. Achten Sie jedoch darauf, die Trachea nicht vollständig zu durchtrennen.

Bringen Sie nun den Trachealtubus in die Luftröhre ein. Sichern Sie beide Seiten der Einführungsöffnung, indem Sie die Nähte darüber verknoten. Anschließend verbinden Sie den Trachealtubus mit einem Mausbeatmungsgerät und einem Kapnographen.

Verbinden Sie dann den Beatmungsapparat über einen Compliance-Beutel mit reinem Sauerstoff. Stellen Sie die Parameter des Beatmungsgeräts so ein, dass die Maus nicht gegen die künstliche Beatmung ankämpft und der endexspiratorische Kohlendioxidpartialdruck zwischen vier und fünf Prozent stabil bleibt. In diesem Schritt wird die Vena jugularis auf einer Seite des Halses mittels stumpfer Dissektion freigelegt.

Die Vena jugularis teilt sich in zwei Hauptstämme auf, die vordere und hintere Gesichtsvene. Trennen Sie die Vene vorsichtig von ihrem umgebenden Bindegewebe. Führen Sie dann zwei Fäden aus Seidenschnur der Stärke sechs unter die Vene ein und platzieren Sie sie so weit wie möglich voneinander entfernt entlang der Länge der Vene.

Als Nächstes wird eine kleine Vaskularklammer auf der proximalen Seite der Vene platziert und die distale Seite der Vene abgebunden. Mit einer sehr feinen Iris-Schere wird ein kleiner Querschnitt in die Vene gemacht. Dabei ist darauf zu achten, die Vene nicht vollständig zu durchtrennen.

Danach einen vorgefüllten einkanaligen Katheter in die Öffnung bis zur Gefäßklemme einführen, die die Vene und den Katheter zusammenhält. Die Gefäßklemme vorsichtig entfernen. Anschließend den Katheter einige Millimeter weiter in die Vene schieben. Den Katheter sichern, indem er auf beiden Seiten der Einführstelle mit Nähten fixiert wird.

Als Nächstes verbinden Sie einen der Katheter mit einer Spritze oder einer Spritzenpumpe, um zusätzliche Dosen von Anästhetika wie Pentobarbital, Natrium oder Ketamin-Xylazin zu injizieren. Wiederholen Sie den Vorgang für eine weitere Vene und verbinden Sie den anderen Katheter mit einer Spritzenpumpe für eine langsame intravenöse Infusion einer 4%igen Glucoselösung, die 1% Natriumbicarbonat und 14% Plasmon enthält. Schließen Sie zum Schluss die Hautoberfläche des Halses mit einer Nadel und Naht.

Anschließend das Tier in Bauchlage zurückbringen. Führen Sie nun einen Schnitt von der Oberschenkelspitze bis zur Achillessehne durch. Lösen Sie die Haut vorsichtig von den darunterliegenden Muskeln und achten Sie darauf, die Blutgefäße nicht zu beschädigen.

Als Nächstes identifizieren Sie den vorderen Rand des Musculus biceps femoris, der als weiße Linie erscheint, die entlang des Oberschenkels verläuft. Öffnen Sie dann vorsichtig entlang dieser Linie vom Knie bis hin zum Hüftknochen. Trennen Sie die Muskeln, um den Nervus ischiadicus unterhalb des Musculus biceps femoris freizulegen.

Dissezieren Sie den Musculus biceps femoris vorsichtig und entfernen Sie ihn. Um den Nervus ischiadicus und die Musculi triceps surae freizulegen, identifizieren Sie den Nervus tibialis zwischen dem Nervus peronaeus communis und dem Nervus suralis. Unter den verschiedenen Ästen des Nervus tibialis unterscheiden Sie die Äste, die den Musculus triceps surae versorgen, von den tiefer verlaufenden Ästen.

Verwenden Sie acht OTT-Seidenfäden, um alle Äste des Nervus tibialis zusammenzubinden, wobei die Äste, die den Musculus triceps surae innervieren, intakt bleiben. Durchtrennen Sie den Nervus tibialis so weit wie möglich vom Knoten entfernt. Identifizieren Sie die Wirbel T 13 und L1, wobei T 13 der letzte Wirbel ist, an dem Rippen angeheftet sind.

Dann immobilisieren Sie die Wirbelsäule mit den Cunningham-Spinalklammern an beiden Seiten von T 13 und L 1. Achten Sie darauf, das Rückenmark nicht zu komprimieren, sondern leichten Zug entlang der Längsachse auszuüben. Stellen Sie sicher, dass die Wirbelsäule gut befestigt ist, indem Sie sie vorsichtig mit einer Pinzette nach unten drücken.

Entfernen Sie mithilfe feiner R-Griffzangen die Dornfortsätze und anschließend das Laminat über T13 und L1, um das Rückenmark freizulegen. Platzieren Sie dann ein speziell angefertigtes Kunststoffbad, das das Rückenmark umgibt. Befestigen Sie das Bad danach mit einem Seidenfaden der Stärke 4 aught.

Als Letztes stellen Sie sicher, dass das Bad wasserdicht ist, indem Sie es mit Schnellguss-Dichtmittel abdichten. Sobald der Schnellguss getrocknet ist, entfernen Sie die Baumwollabdeckung des Rückenmarks und füllen das Bad mit Mineralöl. Verwenden Sie eine weitere Wirbelklemme, um einen Dornfortsatz des Sakralbereichs zu fixieren.

Um den hinteren Bereich des Tieres zu stützen, verwenden Sie eine dritte Klemme, um das rechte Hinterbein und den Knöchel fixiert zu halten, wobei das Bein am Knie und am Knöchel im 90-Grad-Winkel gebeugt ist. Entfernen Sie die Mullbinde, die den Bereich des Hinterbeins bedeckt. Präparieren Sie die Achillessehne vom umgebenden Gewebe frei.

Schneiden Sie den Trizeps so weit wie möglich aus dem umgebenden Gewebe heraus, indem Sie eine durchbohrte Nadel verwenden. Fädeln Sie eine Seidennaht der Stärke sechs aught durch die Achillessehne und knoten Sie sie dreifach um die Sehne. Bringen Sie dann den Kraftaufnehmer nahe am Knoten an.

Danach das Sehnenstück mit dem Seidenfaden am Kraftaufnehmer befestigen und den distalen Teil der Sehne durchtrennen. Anschließend zwei Edelstahldrähte unter die Faszie der Musculus-triceps-sury-Muskeln einführen. Diese Drähte sind mit einem extrazellulären Wechselstromverstärker verbunden.

Platzieren Sie für die EMG-Aufzeichnung den Nervus tricipitis surae an der Kathode einer Hakenelektrode, wobei die Anode einen benachbarten Muskel berührt. Stimulieren Sie anschließend den Nervus tricipitis surae mit einem 50 Mikrosekunden langen Rechteckimpuls zunehmender Intensität bei niedriger Frequenz, bis die maximale Zuckungsamplitude beobachtet wird. Wiederholen Sie dann die Stimulation des Nervus tricipitis surae mit einem 50 Mikrosekunden langen Rechteckimpuls zunehmender Intensität bei niedriger Frequenz, bis die maximale Zuckungsamplitude erreicht ist.

Diese Abbildungen zeigen, wie man ein Motoneuron aus der Trizeps-sury-Gruppe identifiziert. Nach Eindringen bei geringer Reizintensität kann bei höherer Intensität nur ein monosynaptisches EPSP beobachtet werden. Das EPSP kann bei noch höherer Reizintensität groß genug sein, um einen orthodromen Aktionspotentialausbruch auszulösen, und zwar nach dem Alles-oder-Nichts-Prinzip.

Ein antidromischer Aktionspotential kommt mit einer kürzeren Latenz als das monosynaptische EPSP auf. Wenn genügend Strom über die Mikroelektrode injiziert wird, um ein Aktionspotential auszulösen, kann eine EMG-Aktivität im Muskel nach einer kurzen Verzögerung registriert werden, gefolgt von einem Muskelzucken.

Nach der Identifizierung des Motoneurons können dessen elektrophysiologischen Eigenschaften charakterisiert werden. Beispielsweise veranschaulicht diese Abbildung, wie der Eingangswiderstand mithilfe von hyperpolarisierenden und depolarisierenden Stromimpulsen gemessen werden kann, indem die Änderungen des Membranpotentials in Abhängigkeit von der injizierten Strommenge aufgetragen werden. Die kontraktilen Eigenschaften der motorischen Einheit können ebenfalls mit verschiedenen Stimulationsprotokollen untersucht werden.

Beispielsweise kann die Kraft-Frequenz-Beziehung ermittelt werden, indem kurze Stromimpulse mit verschiedenen Frequenzen in das Motoneuron injiziert werden. Die stationäre Kraft kann dann gegen die Frequenz der Stromimpulse aufgetragen werden, um eine sigmoidale Kraft-Frequenz-Kurve darzustellen. Nach Beherrschung der chirurgischen Technik kann ein Teil dieses Verfahrens bei perfekter Durchführung innerhalb von drei Stunden durchgeführt werden.