Gleichzeitige Elektroenzephalographie, Real-time Messung der Laktat-Konzentration und optogenetische Manipulation der neuronalen Aktivität in der Nagetier Cerebral Cortex

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, die EEG-definierte Schlafphase und die Lactatkonzentration während einer optogenetischen Stimulation an präzisen stereotaktischen Koordinaten zu messen. Operativ implantieren Sie die erforderlichen elektroenzephalographischen Ableitungen sowie Kanülen für einen Lactatsensor und ein Lichtleiterkabel. Anschließend führen Sie das Lichtleiterkabel und den vorkalibrierten Lactatsensor in ihre Führungskanülen im Schädel des Tieres ein.

Als Nächstes stellen Sie die Intensität des blauen Lichtreizes so ein, dass die gewünschte elektrophysiologische Antwort erzielt wird. Anschließend erfassen Sie die elektroenzephalographischen, elektromyographischen und Lactatkonzentrationsdaten, während das Tier frei verhalten oder schlafen kann. Im Vergleich zu anderen Methoden wie pharmakologischen EEG-Studien bietet dieser experimentelle Ansatz den Vorteil, dass die Hirnbiochemie und -elektrophysiologie überwacht werden können, während die Aktivität von Neuronen in Echtzeit auf einer subsekundären Zeitskala manipuliert wird.

Das Potenzial, neue Erkenntnisse für die Schlafforschung zu gewinnen, ist daher hoch. Beispielsweise lassen sich metabolische und elektrophysiologische Begleiterscheinungen des Tiefschlafes identifizieren. Dieser Experimenttyp kann auch in anderen Bereichen der Neurowissenschaften angewendet werden, wie zum Beispiel beim Lernen und Gedächtnis, der synaptischen Plastizität oder bei Anfallsstörungen.

Die chirurgische Technik ist technisch anspruchsvoll. Sie erfordert eine große Geschicklichkeit, die jedoch durch Übung erworben werden kann. In dieser visuellen Demonstration werde ich die kritischen Schritte einiger komplizierter chirurgischer Verfahren erläutern, die die schriftliche Beschreibung ergänzen.

Nachdem sich ein Tier von der Operation erholt hat, besteht die Herausforderung darin, den Lactatsensor und das Lichtleiterkabel korrekt einzusetzen. Jonathan und ich werden demonstrieren, wie man das Tier mit fester Hand fixiert, um diese beiden empfindlichen Geräte einzuführen. Schließlich zeigen wir, wie man die EEG-Antwort optimiert, indem man die Stimulationsintensität in Echtzeit anpasst.

Verwenden Sie für dieses Experiment transgene Mäuse, die den auf blaues Licht empfindlichen Kationenkanal exprimieren. Der Kanal wird in zwei Typen zerebraler kortikaler Neuronen exprimiert. Betäuben Sie zunächst die Maus zur Induktion mit 5 % Isofluran und 95 % Sauerstoff und erhalten Sie die Narkose mit 3 % Isofluran und 97 % Sauerstoff aufrecht.

Führen Sie einen medianen Schnitt auf der Schädeloberseite von zwischen den Augen bis zum Hinterkopf durch. Reinigen Sie den Schädel mit Wasserstoffperoxid und steriler Kochsalzlösung. Lokalisieren und markieren Sie B und Lambda, um die stereotaktischen Koordinaten für die Elektroden-Optogenetik-Stimulationskonfigurationen zu bestimmen; bohren Sie zunächst mit einem Hochgeschwindigkeits-Zahnbürstgerät mit einem 0,5-Millimeter-Kugelfräser und anschließend mit einem 0,7-Millimeter-Kugelfräser die Schraubenlöcher vor.

Setzen Sie die Elektrodenschrauben mit einem Schlitzschraubendreher in die Bohrungen ein. Drehen Sie sie etwa vier bis fünf Umdrehungen ein, um die gewünschte Tiefe zu erreichen. Halten Sie die Leitungskanülen mit einer stereotaktischen Kanüle an Ort und Stelle und befestigen Sie sie dann mit Acrylzement am Schädel und an den Ankerpunkten. Um die Durchgängigkeit aufrechtzuerhalten, sollte jede Leitungskanüle von der Operation bis zur Experimentierung eine Platzbosonde oder einen Innenstab enthalten.

Nachdem die EEGs und Leitungskanülen im Schädel positioniert sind, verbinden Sie diese mit einer dünnen Schicht aus zahnärztlichem Acrylzement. Nachdem der Zement erstarrt ist, positionieren Sie den Kunststoffverbinder über dem getrockneten Zementvorsprung und verlöten die Enden der Drähte, die von den EEG-Leitungen ausgehen, mit den Kontakten auf dem Kunststoffverbinder, falls die Drahtleitungen im Zement liegen. Ziehen Sie anschließend die Elektromyogramm-Drähte durch die Nackenmuskulatur, indem Sie sie in den Schaft einer 21-Gauge-Nadel einführen.

Durch die Muskulatur hindurch wird eine doppelte chirurgische Schlinge aus Nylonfaden der Stärke 5-0 um diese Drähte geknotet, und zwar unmittelbar distal zu der Stelle, an der sie aus dem Muskel austreten. Die Haut, die zur Zugänglichmachung des Muskelgewebes zurückgezogen wurde, wird mit einzelnen unterbrochenen chirurgischen Knoten unter Verwendung einer rückwärts schneidenden P-3-Nadel und Nylonfaden der Stärke 5-0 wieder zusammengenäht. Sobald die mc-Reizungseinheit programmiert ist, wird sie als eigenständiger Signalgenerator mit einem binären Ein-Aus-Signal von fünf Volt betrieben. Die mc-Reizungseinheit wird über BNC-Stecker mit der TTL-fähigen Stromversorgungseinheit des Lasers verbunden.

Verbinden Sie die Laserleistungseinheit über ein Flachbandkabel mit dem Laser. Verbinden Sie außerdem den Laser mit dem männlichen FC-Stecker des ursprünglichen Glasfaser-Patchkabels. Schließen Sie das ursprüngliche Glasfaserkabel an das Drehgelenk an.

Das Kommutator-Faseroptik-Drehgelenk fungiert als Kommutator. Während sich das Tier in seinem Käfig bewegt, dreht sich das Drehgelenk, um Bruch der Faseroptikkabel durch Drehmoment zu verhindern. Befestigen Sie den Kommutator mit Kunststoffkabelbindern an einem Metallständer, der über dem zylindrischen Käfig positioniert ist, in dem das Tier untergebracht ist.

Halten Sie die Maus fest, indem Sie mit einer Hand die Maus unter einer hohlen Handfläche fixieren. Richten Sie den Kopf zwischen dem Mittel- und Zeigefinger des Experimentators aus. Entfernen Sie nun Verunreinigungen aus der Leitkanüle mit einer sterilen Nadel der Größe 25 Gauge.

Bringen Sie dann das Glasfaserkabel manuell ein und befestigen Sie es mit einer verschraubbaren Kappe am Kanülenführungsstück für die Glasfaser. Steuern Sie die Einführtiefe des Glasfaserkabels im Gehirn mittels eines auf dem Glasfaserkabel in einem festgelegten Abstand vom flachen, abgespaltenen Ende angebrachten Nahtknotens. Der Sensor wird in phosphatgepufferter Kochsalzlösung equilibriert und nacheinander drei Konzentrationen von L-Lactat schrittweise ausgesetzt.

Gemäß den Herstellervorgaben den vorkalibrierten Sensor genauso in die im Schädel montierte Lactat-Guide-Kanüle einsetzen wie bei der Insertion der Lichtwellenleiterkabel. Den Lactat-Sensor mit dem Vorverstärker des Pinnacle 8,400-Biosensors über bipolare Steckverbinder anschließen. Anschließend diesen Vorverstärker mit dem Acht-Pin-Stecker am chirurgisch implantierten Kopfmontageadapter verbinden.

Bevor Sie Daten sammeln, verwenden Sie den Regler zur Laserintensitätskontrolle, um die Intensität des optogenetischen Stimulus einzustellen. Die Amplitude der EEG-Antwort variiert zwischen Tieren aufgrund von Faktoren, die nicht systematisch untersucht wurden. Daher ist es notwendig, die Intensität des optogenetischen Stimulus anzupassen und zu überprüfen, ob die EEG-Antwort ausreichend ist, sobald die gewünschte Reaktion erreicht ist.

Sammeln Sie Daten mithilfe des Pinnacle 8, 400-Systems mit dem Neuro-Score. Eine SEIA-Schnittstelle klassifiziert die Schlafzustände durch visuelle Inspektion der EEG- und EMG-Daten. Die Daten werden in Zehn-Sekunden-Epochen als Wachzustand, Nicht-REM-Schlaf oder REM-Schlaf basierend auf dem EEG und EMG eingeteilt.

Diese optogenetische Stimulationskonfiguration des Biosensors zeigt chirurgisch implantierte EEG-Elektroden, einen Lactatsensor und eine Kanüle zur optogenetischen Stimulation. In Abwesenheit einer optogenetischen Stimulation durchlief diese Maus spontanen Schlaf. Wachzustandsübergänge wurden erfasst, während E-E-G-E-M-G und die zerebrale Lactatkonzentration kontinuierlich überwacht wurden, und zwar im Wachzustand sowie in den beiden Schlafsubtypen.

Schlafphasen mit schnellen Augenbewegungen und solche ohne schnelle Augenbewegungen werden anhand des EEG und des EMG definiert. Interessanterweise steigt der Strom des Laktat-Biosensors in Abhängigkeit von niederamplitudigem EEG an und fällt in Abhängigkeit von hochamplitudigem EEG ab. Beide EEG-Kanäle reagieren auf optogenetische Reize, die im frontalen Kortex appliziert werden.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man eine Maus chirurgisch für die gleichzeitige optogenetische Stimulation und gleichzeitige Messung des Elektroenzephalogramms, Elektromyogramms und der Laktatkonzentration im Gehirn präpariert. Sobald die Technik beherrscht ist, kann dieser chirurgische Eingriff in 90 bis 120 Minuten ordnungsgemäß durchgeführt werden. Denken Sie daran, die Atmung des Tieres ständig als Indikator für die Tiefe der Anästhesie zu überwachen.

Wenn das Tier seltener als einmal alle vier bis fünf Sekunden atmet, könnte die Anästhesie zu tief sein. Wenn das Tier häufiger als einmal alle zwei Sekunden atmet, könnte die Anästhesie zu flach sein. Denken Sie daran, die geeigneten Sicherheitsvorkehrungen zu treffen, wenn das gasförmige Anästhetikum Isofluran verwendet wird.

Stellen Sie eine ausreichende Belüftung im Operationsbereich sicher, um Ihre Netzhaut vor dem Laser, der für die optogenetische Stimulation verwendet wird, zu schützen. Tragen Sie entweder Schutzbrille oder stellen Sie das Tier in einen lichtdichten Schrank. Sie sollten das Implantieren des Laktat-Biosensors und des Lichtwellenleiters an einer vollständig wachen Maus üben.

Mäuse halten sich nicht an diese Verfahren und müssen immobilisiert werden. Die Fixierung darf jedoch nicht so stark sein, dass sie das Tier verletzt oder die Atmung behindert.