Quantitative Messung der Immunantwort und Sleep in

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments besteht darin, Schlaf und Immunfunktion bei Drosophila zu untersuchen. Zunächst wird dazu die motorische Aktivität infizierter Fliegen aufgezeichnet, um den Schlaf zu messen. Im zweiten Schritt nach der Infektion werden die Fliegen homogenisiert, verdünnt und auf LB-Agarplatten ausgestrichen. Die Anzahl der wachsenden koloniebildenden Einheiten zeigt die Fähigkeit der Fliegen an, die Infektion abzuklären.

Anschließend werden infizierte Fliegen, die ein Transgen mit dem NF-kappa-b-Luciferase-Reporter exprimieren, in eine 96-Loch-Platte gegeben, die Luciferingehalt, das Substrat der Luciferase, enthält. Die Echtzeitmessung der kappa-b-Luciferase zeigt die Aktivierung eines NF-kappa-B-Signalwegs während der Infektion sowie den Überlebensausgang unter Schlafentzug an. Die Bestimmung der bakteriellen Eliminierung und die NF-kB-Reporteraktivität sind Messgrößen, die Einblicke in den molekularen Zusammenhang zwischen Immunfunktion und Verhalten ermöglichen.

Im Allgemeinen haben Personen, die neu bei dieser Methode sind, Schwierigkeiten, da es Zeit und Übung erfordert, um zu lernen, Fliegen konsistent manuell zu infizieren. Der Hauptvorteil der Lucifer-Assay-Technik gegenüber bestehenden Methoden wie der QPCR besteht darin, dass die NF-kappaB-Aktivität kontinuierlich in Echtzeit in lebenden Fliegen gemessen werden kann. Beginnen Sie damit, Drosophila-Kulturen im späten Puppenstadium drei bis vier Tage lang zu inkubieren, damit sich die erwachsenen Tiere an die Umweltbedingungen anpassen können.

Hier werden die Fliegen unter konstantes Licht gestellt, um den Einfluss der circadianen Uhr auf die Immunantwort und das Verhalten auszuschließen. Danach werden ein bis vier Tage alte Fliegen in das Aktivitätsmonitoring eingebracht. Die Monitore erfassen ihre Aktivität mindestens drei Tage vor der Infektion, einen Tag vor der geplanten Infektion.

Entnehmen Sie mit einer sterilen Pipettenspitze eine einzelne SIA-Kolonie und tauchen Sie die Spitze in ein Kulturgefäß mit fünf Millilitern LB-Medium, um die sterile Technik zu überprüfen. Vergessen Sie nicht, eine Kontrollkultur ohne Bakterien anzulegen. Kultivieren Sie die Bakterien über Nacht, bis sie am nächsten Tag die exponentielle Wachstumsphase erreichen.

Messen Sie die Extinktion der Kultur bei 600 Nanometern. Verwenden Sie eine zweite Q-Vet als Blindprobe. Die Kultur ist fertig, wenn die Konzentration zwischen 0,5 und 1 Extinktionseinheiten liegt; führen Sie gegebenenfalls eine Unterkultur durch oder verlängern Sie die Kultivierungszeit nach Bedarf.

Bereiten Sie nun die Bakterienlösung zur Infektion der Fliegen vor. Verdünnen Sie die Bakterien mit PBS auf eine erwartete Extinktion von 0,1 bei 600 Nanometern. Fügen Sie anschließend Lebensmittelfarbstoff als Injektionskontrolle hinzu.

Ersetzen Sie die Bakterien durch LB-Medium. Lagern Sie beide Lösungen auf Eis. Stellen Sie anschließend unter einem Stereomikroskop mit einem Mikropipettenzuggerät Injektionsnadeln mit feiner Spitze her.

Verwenden Sie feine Pinzetten, um die Spitze jeder Nadel abzubrechen, sodass die Öffnung groß genug ist, um sie durch Saugkraft mit Injektionsflüssigkeit zu füllen, aber gleichzeitig klein genug bleibt, um die Fliege so wenig wie möglich zu verletzen. Befestigen Sie eine Glasnadel mit Hilfe der Spritze mittels eines Schlauckstücks an einer 3-cc-Kunststoffspritze. Der Fluss des Injektionsmediums wird manuell gesteuert.

Vermeiden Sie es, den Gummischlauch mit Injektionsflüssigkeit zu kontaminieren, da die Spritzenvorrichtung sowohl für infektiöse als auch für Kontrollinjektionen verwendet wird. Überprüfen Sie den Durchfluss des Injektionsmediums mit Hilfe eines Kim-Wipe-Tuchs. Zwei entscheidende Faktoren für erfolgreiche Injektionen sind die Verwendung der optimalen Nadelgröße und die dichte Abdichtung zwischen Nadel und Spritze.

Wenn das Injektionssystem vollständig vorbereitet ist, betäuben Sie die Fliegen mit einem minimalen Strom von Kohlendioxid und arbeiten Sie schnell, sodass keine Fliege länger als fünf Minuten betäubt bleibt. Injizieren Sie nun die Fliegen, indem Sie die Glasnadel in den Bereich oberhalb des Skutellums des dorsalen Thorax stechen. Das Eindringen des Injektionsmediums in die Fliege wird durch die Lebensmittelfarbe bestätigt, die sichtbar wird, sobald sich die injizierte Lösung ausbreitet.

Bevor Sie beginnen, stellen Sie sicher, dass alle für dieses Verfahren verwendeten Materialien mindestens einen Tag im Voraus autoklaviert wurden. Bereiten Sie 10-Zentimeter-Petri-Schalen mit LV-Agar-Medium vor. Am Tag des Experiments betäuben Sie die Fliegen und geben sie in 1,5-Milliliter-Zentrifugenröhrchen.

Bereiten Sie pro experimenteller Bedingung mindestens zwei Gruppen mit jeweils 10 Fliegen vor. Bereiten Sie außerdem eine Kontrollgruppe mit nicht infizierten Fliegen vor, insbesondere wenn Sie einen Bakterienstamm ohne Antibiotikaresistenz verwenden. Lagern Sie alle beladenen Röhrchen auf Eis.

Fügen Sie anschließend 400 Mikroliter LB-Medium zu jedem mit Fliegen beladenen Röhrchen hinzu. Homogenisieren Sie die Fliegen mithilfe eines kleinen Stößels und führen Sie diesen Schritt in der Nähe einer Flamme durch, um Kontaminationen zu vermeiden. Verdünnen Sie nun mittels abgeschnittener Pipettenspitzen das Homogenat in Schritten von Faktor 10 in Volumina von jeweils 200 Mikrolitern.

Falls das Homogenat unmittelbar nach der Infektion mit Sia hergestellt wird, verdünnen Sie es bis zu einem Verhältnis von 1 zu 1000; für das Homogenat 24 Stunden nach der Infektion verdünnen Sie bis zu einem Verhältnis von 1 zu 100.000. Anschließend impfen Sie die beiden höchsten Verdünnungen auf 10-Zentimeter-Platten unter Verwendung von Glasbällchen aus, um eine gleichmäßige Verteilung sicherzustellen, und inkubieren die Platten über Nacht. Am nächsten Tag zählen Sie die Anzahl der Kolonien auf der Platte entweder durch direkte Beobachtung oder mithilfe einer Koloniezählsoftware.

Berechnen Sie anschließend die Anzahl der koloniebildenden Einheiten pro Fliege. Dieser Test verwendet transgene Fliegen, die den Kappa-B-Luciferase-Reporter tragen, zum geeigneten Zeitpunkt. Für den Test werden außerdem kultivierte Bakterien wie SCIA benötigt, die gemäß der Beschreibung im vorherigen Abschnitt für die Injektion vorbereitet wurden.

Passt die Fliegen an die experimentellen Lichtbedingungen an. In diesem Beispiel werden ein bis vier Tage alte Kappa-b-Luciferase-Fliegen in Vials mit einem Nährmedium aus 5 % Saccharose und 2 % Agar gehalten und für zwei Tage in Dauerlicht gegeben. Bereiten Sie nun eine 96-Well-Mikroplatte für die Fliegen vor.

Füllen Sie jedes Well mit zwei Schichten Nahrung. Zuerst Medium: geben Sie 300 µL einer 5%igen Saccharose-Lösung mit 2% Agar in jedes Well. Bedecken Sie die Platte anschließend mit einem feinen Netzgewebe und lassen Sie die Platte bis zu einer Stunde lang gründlich trocknen.

Fügen Sie danach eine 50 µL dicke Deckschicht zu jedem Loch hinzu, die 5 % Saccharose, 1 % Agar und zwei Millimolar Lucifer enthält. Da Lucifer lichtempfindlich ist, lassen Sie die Platte ab sofort im Dunkeln trocknen. Minimieren Sie die Lichtexposition der Platte.

Nachdem das Agar abgekühlt ist, bedecken Sie die Platte mit einer durchsichtigen Klebefolie. Anschließend perforieren Sie die Folie mit einer feinen Nadel zweimal über jedem Brunnen. Diese Löcher ermöglichen den Gasaustausch und eine gasförmige Anästhesie.

Danach, um das Beladen der Fliegen zu erleichtern, einen Schnitt zwischen jeder Spalte mit einer scharfen Klinge und einer geraden Kante einfügen. Die Fliegen mit Kohlendioxid betäuben und sie einzeln Spalte für Spalte in die Vertiefungen laden. Falls eine Fliege an der Folie hängen bleibt, sollte man ihr die Möglichkeit geben, sich selbst zu befreien, bevor man eingreift.

Bringen Sie die Mikrotiterplatte für acht bis 24 Stunden zurück in den Inkubator unter konstantem Licht. Um die in den Vertiefungen befindlichen Fliegen zu betäuben, verwenden Sie eine Mikropipettenspitze, die an eine Niederdruck-Kohlendioxidleitung angeschlossen ist. Stellen Sie sicher, dass das Gas in harmlos niedrigem Druck vorliegt, und platzieren Sie die Mikropipettenspitze direkt über den Belüftungsöffnungen, um jeweils acht Fliegen einzeln zu betäuben.

Überführen Sie jede Fliege auf ein CO2-Kissen und infizieren Sie sie wie zuvor mit Bakterien. Bringen Sie anschließend jede Fliege in das ursprüngliche Loch zurück und versiegeln Sie die Mikrotiterplatte erneut. Messen Sie die Lumineszenz jeder Fliege mithilfe eines Luminometers, das sich in einem temperaturgeregelten Raum unter einem definierten Beleuchtungsplan befindet.

Die Platten in die Stapelkassette einlegen, wobei sichergestellt werden muss, dass die Platten mit den Fliegen zwischen klaren, leeren Platten gestapelt werden. Das Luminometer gemäß den Herstellerangaben programmieren und mindestens 24 Stunden lang stündlich Messwerte erfassen. In diesem Beispiel sind die Detektoren so programmiert, dass jede Vertiefung 10 Sekunden lang ausgelesen wird.

Nach Abschluss die Datendateien in eine Tabellenkalkulation exportieren und eine Standardanalyse durchführen, bei der die Ergebnisse grafisch dargestellt werden. Die Beispieldaten können analysiert werden. Rabatte pro Sekunde, gemittelt aus drei Messwerten pro Mulde.

Wildtyp-Fliegen vom Typ Canton S und relish. E20-Mutanten-Fliegen, denen das NF-kappa-B-Gen fehlt, wurden in zwei Aktivitätsmonitore bei konstantem Licht geladen und mit sia infiziert. In diesem Beispiel förderte die Infektion den Schlaf.

Es zeigte sich, dass relish E 20-Mutanten nach der Infektion weniger Schlaf erhielten als Canton-s-Kontrollfliegen. In Übereinstimmung mit früheren Befunden starben die relish E 20-Mutanten außerdem rasch an der Infektion im Vergleich zu Wildtyp-Fliegen.

Die meisten Fliegen überlebten die aseptische Kontrollinjektion, was darauf hindeutet, dass die Fliegen an der Infektion und nicht an der Verletzung durch die Injektion starben. Da die relish-Mutanten so schnell starben, wurden nur Canton-s-Fliegen verwendet, um die bakterielle Belastung nach der Infektion zu demonstrieren. Sia proliferierte weiterhin in der Fliege 24 Stunden nach der Infektion.

Die Reporteraktivität von Lucifer wies große Variationen zwischen einzelnen Fliegen und zwischen den einzelnen Datenpunkten auf. Obwohl das Signal von allen Geweben innerhalb der Fliege stammt, wird nicht erwartet, dass jedes Gewebe dieselbe Menge an Signal abgibt, und die Sichtbarkeit des Gewebes für den Detektor variiert, während sich die Fliege bewegt. In diesem Beispiel wurden Fliegen infiziert und mit einer behandelten Kontrollgruppe verglichen.

Fliegen, die verstarben, wurden bei der Analyse einer Fliegengruppe ausgeschlossen. Die Luciferase-Reporteraktivität von Kappa b stieg nach der Infektion kontinuierlich an. Die Aktivität des Kappa b-Luciferase-Reporters stieg auch nach einer aseptischen Verletzung kontinuierlich an.

Die maximale Aktivität lag bei beiden, nach Verletzung und nach Infektion, bei etwa 12 Stunden. Nachdem Sie dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man die Immunfunktion und den Schlaf nach einer Infektion bei SSO quantifizieren kann. Wir können Schlaf, Überleben, Zeit, bakterielle Eliminierung und die Echtzeit-Aktivität eines un copy Transkriptionsreporters messen.