Das allgemeine Ziel dieses Verfahrens besteht darin, F1 F zero APAs-Vesikel aus Rattenhirn zu isolieren, um Patch-Clamp-Aufzeichnungen durchführen zu können. Dies wird erreicht, indem zunächst das Gehirn einer Ratte entfernt und homogenisiert wird. Der zweite Schritt besteht darin, synaptische Zonen durch Anlegen von Druck zu disruptieren.

Anschließend werden die Synaptosomen auf die Phial-Gradienten aufgeschichtet. Der letzte Schritt besteht darin, mit Digitonin und L zu inkubieren, um die endgültigen Vesikel für die Patch-Clamp-Aufzeichnung zu erhalten. Eine wichtige Funktion der Mitochondrien ist die ATP-Produktion durch oxidative Phosphorylierung.

Das Enzym, das für eine TP-Produktion verantwortlich ist, ist die A TP-Synthase, die sich in der inneren mitochondrialen Membran befindet. Um die Funktion der A TP-Synthase detailliert zu untersuchen, isolieren wir spezielle submikrosomale Vesikel, die wir SMVs nennen. Diese enthalten das Enzym A TP-Synthase in einer umgestülpten Konfiguration.

Anschließend nehmen wir diese SMVs mit einer Patch-Clamp-Elektrode auf und bestimmen die Undichtigkeit ihrer Membran. Das liefert uns Informationen über die Effizienz der TP-Produktion durch die Mitochondrien. Sylvia Ti, eine Postdoktorandin in meinem Labor an der Yale University, wird dieses Verfahren heute demonstrieren.

Bei diesem Verfahren wird nach der Gewinnung des Kopfes einer Ratte durch Enthauptung die Haut durchtrennt, um den Schädel freizulegen, anschließend wird der Schädel vorsichtig durch Aufschneiden mit einer Schere oder Rons geöffnet. Danach wird das Gehirn entfernt, das Kleinhirn ausgeschlossen, das Gehirn fein zerkleinert, gepuffert und dann vorsichtig in einen fünf Milliliter fassenden Glas-Teflon-Homogenisator überführt, wo das Gewebe zehnmal homogenisiert wird, insgesamt etwa fünf Minuten lang. Anschließend wird die Probe in einer Tischzentrifuge bei 1.500 × g für 10 Minuten bei vier Grad Celsius zentrifugiert.

Speichern Sie das Überstand mit Mitochondrien und Synaptosomen und verwerfen Sie das Pellet. Zentrifugieren Sie anschließend erneut mit 16.000 × g für 10 Minuten bei vier Grad Celsius in einer Tischzentrifuge. Danach verwerfen Sie den Überstand und resuspendieren das Pellet in 500 Mikrolitern Isolierpuffer. Stören Sie das Synaptosom mit einem Zellzerreißgefäß, indem Sie einen Druck von 1.200 PSI für 10 Minuten anwenden, gefolgt von einer schnellen Entspannung. Schichten Sie die zerstörten Synaptosomen auf die Zentrifugenröhrchen mit zwei unterschiedlichen Konzentrationen von Ficoll, die zwei Schichten bilden werden.

Als Nächstes die Röhrchen in einen SW 50.1-Rotor geben und bei vier Grad Celsius 20 Minuten lang mit 126.500 ×g zentrifugieren. In einem Ultrazentrifugat stellt das Pellet die gereinigten Mitochondrien dar. Die Schicht zwischen den unterschiedlichen Dichten der Fial ist der ungestörte Synaptosom.

Anschließend wird das Pellet durch Zentrifugation in Isolationspuffer bei 16.000 × g für 10 Minuten bei vier Grad Celsius in einer Tischzentrifuge gewaschen. Nun resuspendieren Sie die Mitochondrien in 200 Mikrolitern Isolationspuffer, kombiniert mit einem gleichen Volumen von 1 % Digitonin.

Stellen Sie es 15 Minuten lang auf Eis. Fügen Sie anschließend mehr Isolierungspuffer hinzu und zentrifugieren Sie bei 16.000 × g für 10 Minuten bei vier Grad Celsius. Wiederholen Sie diesen Vorgang zweimal, lösen Sie das Pellet dann in 200 Mikrolitern Isolierungspuffer auf und geben Sie zwei Mikroliter 10 % Laemmli-Puffer hinzu, mischen Sie gründlich und stellen Sie es 15 Minuten lang auf Eis.

Danach die Mischung in Isolationspuffer in die Zentrifugenröhrchen schichten. Die Röhrchen in einen SSW 50.1-Rotor geben und eine Stunde lang bei 182.000 × g und vier Grad Celsius zentrifugieren. Nach einer Stunde.

Waschen Sie die endgültige Probe durch Zentrifugation im Isolationspuffer bei 16.000 × g für 10 Minuten bei vier Grad Celsius. Eine typische Elektrophysiologie-Anlage umfasst einen Verstärker, einen PC mit einer Digi Data 1.440, einer Analog-Digital-Wandler-Schnittstelle in Verbindung mit P-Clamp 10.0, Software-Manipulatoren, ein Mikroskop, einen vibrationsisolierten Tisch und eine Faraday-Käfig. Ziehen Sie zunächst eine Pipette aus einer Borosilikat-Glaskapillare mit einem Flaming-Brown-Mikropipettenzieher.

Der optimale Widerstand der Pipette sollte zwischen 80 und 100 Megaohm liegen. Geben Sie die submikrosomalen Vesikel in eine physiologische intrazelluläre Lösung. Füllen Sie dann eine Patch-Clamp-Pipette mit derselben Lösung.

Die Vesikel im Phasenkontrast sichtbar machen. Mikroskopie nachdem SMVs bei Raumtemperatur gepatcht wurden. Die Aktivität aufzeichnen, wenn das Membranpotenzial für jeweils 10 Sekunden im Bereich von minus 100 Millivolt bis plus 100 Millivolt gehalten wird.

Die aufgezeichneten Daten werden mit der Verstärkerschaltung bei fünf Kilohertz gefiltert und mit der Clampfit-10.0-Software analysiert. Diese Abbildung zeigt die Aufarbeitung eines Lysats, der aus Zytoplasma und Mitochondrien hergestellt wurde. Das obere Feld zeigt eine Immunoblot-Analyse unter Verwendung eines Antikörpers gegen das zytosolische Protein GA dh.

Das untere Panel zeigt eine Blot-Aufnahme mit einem Antikörper gegen das Protein der mitochondrialen Innenmembran. Cox vier Hier sind zwei repräsentative Patch-Clamp-Aufnahmen vor und nach der Zugabe von einem Millimolar aTP. Das Haltepotential beträgt positiv 70 Millivolt. Die gestrichelte Linie stellt null Pikoampere dar.

Jede Spur wird 10 Sekunden lang aufgezeichnet, und es liegen 10 Sekunden zwischen den Spuren. Hier sind Beispielkurven der zeitlichen Änderungen der Fluoreszenzintensität des CMA-Indikators in Gegenwart von SMV sowie in Abwesenheit und Gegenwart eines TP. Nachdem Sie dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man Mitochondrien und submikrosomale Vesikel, die F1-F0-ATP-Synthase enthalten, isoliert. Außerdem sollten Sie verstehen, wie man mit einer Elektrode eine widerstandsfähige Dichtung an der Membran des Vesikels bildet, um die Kanalaktivität des ATP-Synthase-Komplexes zu analysieren.