Messe Cytometry: Protokoll für die tägliche Tuning und Ausführen von Zellproben auf einem CyTOF Messe Cytometer

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, die korrekte tägliche Abstimmung und Probennanalyse an einem CyTOF-Gerät zu demonstrieren. Zunächst wird das Gerät zusammengebaut und eingeschaltet. Anschließend werden die Instrumenteneinstellungen für die Abstimmung auf das maximale Signal optimiert.

Die Maschine ist dann bereit, die Proben zu analysieren. Im letzten Schritt wird die Maschine gereinigt und heruntergefahren. Letztendlich können optimale Zelldaten gemäß spezifischer Zeitanforderungen erfasst werden.

Die visuelle Demonstration dieser Technik ist entscheidend. Die täglichen Einrichtungs-, Abstimm- und Reinigungsverfahren sind schwierig aus der Anleitung zu erlernen, da mehrere Software-Schritte gleichzeitig durchgeführt werden müssen.

Sie müssen Erfahrung sammeln, um ein Gefühl für die geeigneten Hintergrundniveaus und Signalintensitäten zu entwickeln. Mindestens 15 Minuten vor Beginn eines Experiments öffnen Sie das CyTOF-Softwareprogramm und wählen die Instrumenteneinrichtung aus. Klicken Sie dann im Reiter „Card Cage“ auf die Schaltfläche „Heater on“, damit das Sprühkammergehäuse 200 Grad Celsius erreichen kann.

Ersetzen Sie die Spritze in der Spritzenpumpe durch eine neue Spritze, die mit Milli-Q-Wasser gefüllt ist. Reinigen Sie anschließend das Nebulisatorgerät, indem Sie zweimal 5 % Citron rückwärts durch jeden Anschluss spülen. Um eventuell verbliebene Reste von Citron zu entfernen, wiederholen Sie den Rückwärtsspülvorgang mit Milli-Q-Wasser.

Öffnen Sie als Nächstes das Ventil des Argon-Gasbehälters, wodurch die Argon-Anzeige an der Vorderseite des Geräts leuchtet. Anschließend befestigen Sie das Zerstäubungsgerät am Zusatzgaszulauf und verbinden das Zerstäubungsgerät mit der Flüssigkeitszuführungsschlauchleitung. Führen Sie das Ende des Zerstäubungsgeräts in die weiße Öffnung im Heizmantel auf der RFG-Regler-Registerkarte im Instrumenteneinrichtungsfenster ein.

Klicken Sie auf „Plasma starten“ und anschließend auf „OK“. Nachdem der Startvorgang abgeschlossen ist, klicken Sie im Popup-Fenster erneut auf „OK“. Schalten Sie nun die Spritzenpumpe ein.

Beim Nachfüllen der Spritze die Stopp-Taste und nicht die Pause-Taste drücken, um den Volumenzähler zurückzusetzen. Stellen Sie vor der Kalibrierung des Massencytometers sicher, dass es 20 Minuten lang aufgewärmt wurde. Sobald sich das Gerät stabilisiert hat, klicken Sie auf die Schaltfläche „Einstellungen zur Datenerfassung“, um das Fenster für die Einstellungen der Datenerfassung zu öffnen. Im Reiter Analyten.

Klicken Sie auf das Periodensystem, um das Isotopenauswahlfeld zu öffnen. Wählen Sie dann die im Handbuch aufgeführten Isotope in der DVS Sciences-Abstimmungslösung aus und klicken Sie auf Speichern. Klicken Sie anschließend auf die Schaltfläche Isotope pro Messung, um das Fenster Massen pro Messung zu öffnen.

Wählen Sie die Impulsanzahl aus und skalieren Sie die y-Achse, indem Sie eine neue Zahl eingeben und dann die Eingabetaste drücken. Füllen Sie nun eine grüne einteilige Ein-Milliliter-Norm-Injektionskanüle mit der Abstimmlösung. Drehen Sie den Probenport-Selector auf „Laden“.

Injizieren Sie 450 Mikroliter Tuning-Lösung und schalten Sie dann den Selektor auf Injektion. Warten Sie, bis die Isotope der Tuning-Lösung in dieser Anzeige als Streifen erscheinen. Die Signale im Zeit-of-Flight-Bereich von 9.400 bis 9.800 resultieren aus Xenon-Isotopen im Argon-Gas.

Kehren Sie nun zu den Massen pro Leseintervall zurück und klicken Sie auf die grüne Wiedergabetaste. Jede farbige Linie stellt ausgewählte Isotope aus der Registerkarte Analyten dar. Wenn die Isotopenkonzentrationen stabil sind, stellen Sie den aktuellen Sollstrom über das Dropdown-Menü in der Registerkarte Parameter des Datenakquisitionseinstellungsfensters ein.

Geben Sie im Startfenster für „Ende“ null ein, für „Start“ 10. Geben Sie für den Schrittweitenwert 0,5 und für die Einschwingzeit 200 ein. Klicken Sie dann auf „Speichern“.

Klicken Sie dann zurück auf das Fenster „Massen pro Messung“ und klicken Sie auf „Wiedergabe“. Nachdem Sie notiert haben, an welchen Stellen die Signale der Isotope ihr Maximum erreichen, wechseln Sie zum Reiter „DAC-Kanal-Einrichtung“ im Fenster „Gerätekonfiguration“. Scrollen Sie nach unten zum Bereich „Strom“ und geben Sie den Wert des Isotopenmaximums ein.

Klicken Sie auf „Istwert festlegen“ und speichern Sie anschließend. Ändern Sie danach das Dropdown-Menü auf „Spülgas“. Geben Sie 0,55 im Startfenster, 0,95 im Endfenster, 0,05 im Schrittweitenfenster und 200 im Stabilisierungszeitfenster ein.

Klicken Sie auf „Speichern“. Nachdem Sie zum Fenster „Massen pro Messung“ zurückgekehrt sind und erneut auf „Wiedergabe“ geklickt haben, zeigt die x-Achse nun die Trägergasflussrate an. Notieren Sie die Werte, bei denen die Signale der Isotope ihre Spitzen erreichen, und beobachten Sie den schnellen Anstieg des GD 1 55-Signals nahe dem Ende.

Kekehren Sie dann zur Registerkarte „DAC-Kanal-Einrichtung“ zurück. Scrollen Sie nach unten zu „Makeup-Gas“ und geben Sie den neuen Isotopen-Peak-Wert ein. Klicken Sie auf „Istwert festlegen“.

Klicken Sie dann erneut auf Speichern, um das Verhältnis des gewünschten Isotops zum Oxid zu erfassen. Führen Sie zunächst eine zweite Injektion von 450 Mikroliter Einstelllösung durch. Wählen Sie anschließend im Parameter-Tab im Dropdown-Menü die Zeit aus und geben Sie im Startfenster null, im Endfenster 10, im Schrittweitenfenster eins und im Anlaufzeitfenster 200 ein.

Nachdem Sie im Fenster „Massen pro Messung“ auf „Abspielen“ geklickt haben, verwenden Sie den Cursor, um den höheren Wert für TM 1 69 oder TB 1 59 sowie den GD 1 55-Wert abzulesen. Injizieren Sie nun drei Milliliter Milli-Q-Wasser durch die Proben-Schleife, gefolgt von 500 Mikrolitern DVS-Waschlösung. Klicken Sie im Reiter „Massenkalibrierung“ auf „Ausführen“, um den Fortschritt der Reinigungswaschung zu überwachen, bis die Intensität der Streifen abzunehmen beginnt.

Anschließend folgen drei Milliliter Milli-Q-Wasser, und die Überwachung wird fortgesetzt, bis die Streifen auf den Hintergrundpegel abgeklungen sind. Beginnen Sie damit, die gerade für die Isotope der Abstimmlösung gezeigten Probenisotope einzugeben, und klicken Sie dann auf Speichern. Öffnen Sie danach das Erfassungsfenster und ändern Sie die Erfassungseinstellungen entsprechend dem Probenvolumen.

Beispielsweise füllt eine 450-Mikroliter-Probe die Probenloop und benötigt 600 Sekunden Laufzeit, um Verzögerungen bei der Erfassung der Celldaten zu berücksichtigen. Stellen Sie die Erfassungsverzögerung auf mindestens 30 Sekunden und die Detektorstabilitätsverzögerung auf mindestens 20 Sekunden, bevor Sie die Messung starten. Waschen Sie die Zellproben mindestens zweimal mit Milli-Q-Wasser und resuspendieren Sie die Probe anschließend mit maximal 106 Zellen pro Milliliter. Filtern Sie die resultierende Zellsuspension durch einen 35-Mikrometer-Zellsieb.

Um eventuelle Aggregate zu entfernen. Geben Sie nun einen neuen Dateinamen für die aktuelle Probe ein. Beachten Sie, dass alle Dateien auf Laufwerk E gespeichert werden müssen.

Danach schalten Sie das Proben-Schleifenventil auf „Laden“, injizieren die Probe, schalten das Proben-Schleifenventil zurück auf „Injizieren“ und klicken dann im Erfassungsfenster auf „Start“. Die Zellen werden im Sichtfenster als horizontale Ansammlungen von Markierungen in jedem vertikalen Isotopenkanal dargestellt und zeigen die beste Auflösung bei etwa 300 bis 500 Zellen pro Sekunde, wie hier gezeigt.

Wenn die Datenaufnahme der Probe abgeschlossen ist, erscheint ein Popup-Fenster. Klicken Sie auf „Okay“, um den Abschluss des Probenlaufs zu bestätigen, und injizieren Sie anschließend mindestens 500 Mikroliter MQ-Wasser zwischen jeder Probe, um eine mögliche Probenübertragung zu minimieren und die Maschine zu reinigen. Nach Gebrauch injizieren Sie 450 Mikroliter Waschlösung in die Proben-Schleife. Überwachen Sie die Freisetzung von freiem Metall und spülen Sie dann die Proben-Schleife mit drei Millilitern Milli-Q-Wasser, wobei Sie den Waschvorgang überwachen, bis Hintergrundwerte erreicht sind.

Danach, um das Gerät abzuschalten, wählen Sie den RFG-Controller-Tab im Instrumenten-Setup-Fenster aus und klicken Sie auf „Plasma stoppen“. Wenn der Vorgang abgeschlossen ist, klicken Sie im Popup-Fenster auf „OK“, worin die Entfernung des Nebelisators unter dem Card-Cage-Tab empfohlen wird. Schalten Sie die Heizung aus, schließen Sie das Ventil an der Argonversorgung und ziehen Sie anschließend den Nebelisator vorsichtig nach hinten, um ihn aus der Sprühkammer zu entfernen.

Als Nächstes schrauben Sie das Probeneinleitungsrohr ab und legen es beiseite. Schrauben Sie die Verbindung für das Zusatzgas so lange ab, bis sie sich leicht löst, und ziehen Sie dann das Zerstäubungsgerät ab. Reinigen Sie schließlich mit derselben Spritze und demselben Schlauch wie zuvor beide Anschlüsse des Zerstäubungsgeräts mit 5 % Citron und lagern Sie das Zerstäubungsgerät bis zum nächsten Gebrauch bedeckt in 5 % Citron.

Eine ausreichende Spülung des Massenzytometers mit UE-Wasser und DVS-Spüllösung verringert die Metallabsorption in den Schläuchen und anderen Teilen der Maschine und trägt dazu bei, die in diesen Grafiken sichtbaren Hintergrundwerte zu reduzieren. Eine unsachgemäße Abstimmung, dargestellt durch die magenta Linie, erhöhte die Oxidbildung bei m plus 16 im Vergleich zur sachgemäß abgestimmten Probe, wie durch die dunkelblaue Linie gezeigt, deutlich an. Dies führt dazu, dass die gewünschten Signale bei m leicht abnehmen und die unerwünschten Hintergrundinterferenzen bei m plus 16 signifikant zunehmen.

Die richtige Waschung und ordnungsgemäße Verdünnung der Proben in Milli-Q-Wasser gewährleisten eine minimale Hintergrundfluoreszenz und die höchstmögliche Auflösung der Zellen, wobei das Erfordernis einer schnellen Analyse berücksichtigt wird. Ähnlich wie in einem repräsentativen Experiment, dessen Daten hier gezeigt werden, wurden in diesem Experiment Polystyrol-Perlen mit natürlich vorkommendem Lanthan 139 ODIUM 140, Terbium 159, DIUM 169 und Lutetium 175 im Zellerfassungsmodus gemessen. Die Daten wurden mit FlowJo analysiert und Trümmer von eventuell zerbrochenen Perlen ausgeschlossen.

Die korrekt abgestimmte Probe wurde bei einer Durchflussrate von 0,74 Litern pro Minute bestimmt, wie durch die dunkelblaue Linie dargestellt. Bei dieser Durchflussrate wurden höhere Signalintensitäten beobachtet als bei niedrigeren Durchflussraten, und es zeigte sich, dass die korrekt abgestimmte Probe ein stärkeres Signal bei den Metallmassen M sowie ein schwächeres Signal bei den um 16 erhöhten Oxidmassen aufwies im Vergleich zu den falsch abgestimmten Signalen. Hier ist eine vergrößerte Darstellung des Signals bei M-Masse LANTHAN 1 39 und THULIUM 1 69 gezeigt.

Beachten Sie, dass die Zusatzgasflussrate die Signalintensität von LANTHANUM 1 39 stärker beeinflusst als die Signalintensität von Thulium 1 69. Diese Diagramme zeigen das Signal bei den m + 16-Oxidmassen 1 55 und 180 5, die den Oxiden von LANTHANUM 1 39 plus OH 16 bzw. Thulium 1 69 plus OH 16 entsprechen. Beachten Sie, dass die Zusatzgasflussrate das Signal bei Masse 1 55 deutlich stärker erhöht als das Signal bei Masse 180 5, da Lanthanum 1 39 leichter oxidiert wird als Thulium 1 69.

Die Signalintensitäten von m und m plus 16 in Abhängigkeit von der Zusatzgasflussrate sind hier dargestellt. Die ausgefüllten Symbole repräsentieren die Masse M, während die offenen Symbole die Masse M plus 16 repräsentieren. Die Farben der Linien entsprechen der jeweiligen Masse M. Beachten Sie, dass die Signalintensitäten von LANTHANUM 1 39 und PRASEODYM 1 41 stark von der Zusatzgasflussrate beeinflusst werden. Es wird sogar ein Punkt erreicht, an dem mehr Oxid der Masse m plus 16 vorhanden ist als die Masse M. Nachdem Sie dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie das CyTOF ordnungsgemäß starten, justieren, Ihre Proben messen und das Gerät am Ende Ihrer täglichen Messungen ordnungsgemäß reinigen und herunterfahren.