Bestimmung der tolerierbaren Fettsäuren und Cholera Toxin-Konzentrationen mit menschlichen Darm-Epithelzellen und BALB / c Maus-Makrophagen

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, tolerierbare Fettsäure- und Cholera-Toin-Konzentrationen zu bestimmen, die das Überleben der Zellen nicht negativ beeinflussen. Dies wird erreicht, indem zunächst der entsprechende Zelltyp gezüchtet wird. Der zweite Schritt besteht darin, die Zellen mit unterschiedlichen Konzentrationen der drei zu testenden Fettsäuren oder mit dem Choleratoxin zu inkubieren.

Nach 24 Stunden wird das Überleben der Zellen mit einem MTT-Assay bewertet. Letztendlich zeigen die Spektrometriedaten des MTT-Assays optimale Konzentrationen von Fettsäuren und Choleratoxin, mit denen Zellen behandelt werden können, ohne das Überleben signifikant zu verringern. Die Auswirkungen dieser Technik erstrecken sich auch auf die Prävention von Cholera-Infektionen, da Impfungen nicht immer erfolgreich sind.

Elch-Musculus-Makrophagen aus Darm-C-Mäusen werden für alle Co-Toxin-Bestimmungen und für die Bestimmung der Konzentration von Fettsäuren in größerem Maßstab verwendet, die Zellen werden in einem von zwei Medien vermehrt: DMEM mit L-Glutamin, ergänzt mit 10 % fötalem Rinderserum und 1 % antibiotischem Antimykotikum oder RPMI 1640-Basismedium, ergänzt mit 10 % fötalem Rinderserum, 5 % L-Glutamin und 1 % Antibiotikum. Antimykotikum für dieses Protokoll, züchten Sie die Darm-C-Zellen in 75 Quadratzentimeter großen Corning-Kolben mit belüfteten Kappen bei 37 Grad Celsius, 95 % Luft und 5 % Kohlendioxid für feine Ablagerungen. Bei der Bestimmung der Fettsäurekonzentration werden menschliche Darmepithelzellen verwendet, die in 75 Quadratzentimeter großen Corning-Kolben mit belüfteten Kappen in Hypercare-Medien mit 10 % FPS und 30 Nanogramm pro Milliliter vermehrt werden.

Humane EGF verwenden keine antibiotischen antimykotischen Reagenzien gemäß den Anweisungen des Herstellers. Inkubieren Sie bei 37 Grad Celsius, 95 % Luft und 5 % Kohlendioxid-Subkulturen, alle Zellen eins bis drei mit etwa 70 % Co-Fluenz, abhängig von der Art der Zellzellen, werden in der Regel alle zwei bis fünf Tage vor der Fettsäurebehandlung subkulturiert. Bereiten Sie die Fettsäuren vor Übertragen Sie zuerst Öl-, Linol- und Linolsäuren aus den vom Unternehmen bereitgestellten Glasampullen in sterilisierte Glasfläschchen. Übertragen Sie anschließend jede Fettsäure in ein separates sterilisiertes Einor-Röhrchen.

Jede Fettsäure in 100%igem Ethanol in einer Verdünnung von eins bis sechs auflösen, gefolgt von der Ausgabe von RPMI 1640. Unvollständige Medien bis zu einer Endkonzentration von 10 Mikrogramm pro Mikroliter. Wirbeln Sie jede Lösung vor und füllen Sie sie in Glasfläschchen zur Lagerung in der Gefrierplatte bei minus 20 Grad Celsius um.

Humane Darmepithelzellen bei 2.500 Zellen pro Vertiefung in 96. Well-Gewebekulturplatten fügen das entsprechende vollständige Medium hinzu, um das Gesamtvolumen jeder Well auf 200 Mikroliter zu bringen. Inkubieren Sie die Zellen 24 Stunden lang bei 37 Grad Celsius, 95 % Luft und 5 % Kohlendioxid.

Entfernen Sie nach Ablauf der 24-stündigen Proliferationszeit das Medium. Geben Sie die entsprechenden Konzentrationen jeder zu testenden Fettsäure als Positivkontrolle in die Vertiefungen. Zellen mit vollständigem Medium als Negativkontrolle inkubieren, Zellen mit 70% Ethanol inkubieren.

Fügen Sie danach das komplette Medium hinzu, um das Gesamtvolumen jeder Vertiefung auf 200 Mikroliter zu bringen. Inkubieren Sie die behandelten Platten 24 Stunden lang, bevor Sie mit dem MTT-Assay beginnen, um das Choleratoxin für die Zellbehandlung vorzubereiten. Löse das Choleratoxin in PBS in einer Konzentration von einem Milligramm pro Milliliter auf.

Aliquotieren Sie die Lösung in Kryo-Fläschchen und lagern Sie sie vor der Zellbehandlung bei zwei bis acht Grad Celsius. Verdünnen Sie das Toxin eins bis hundert in sterilisiertem PBS oder unvollständigem DMEM für eine endgültige Arbeitskonzentration von einem Nanogramm pro Mikroliterplatte. Makrophagen bei 2.500 Zellen pro Well in 96.

Well-Gewebekulturplatten inkubieren 24 Stunden lang bei 37 Grad Celsius, 95 % Luft und 5 % Kohlendioxid. Nach der 24-stündigen Vermehrungsphase entfernen Sie das Medium und geben Sie die entsprechenden Testkonzentrationen von Cholera-Toin in die Vertiefungen. Ähnlich wie bei den Fettsäurebehandlungen inkubieren Sie Zellen mit vollständigem Medium als Positivkontrolle und 70 % Ethanol als Negativkontrolle für alle Proben und Behandlungen.

Verwenden Sie mindestens drei Replikationen mit mehr Replikationen für positive Kontrollen. Fügen Sie das komplette Medium hinzu, um das Gesamtvolumen jeder Vertiefung auf 200 Mikroliter zu erhöhen. Inkubieren Sie die mit Choleratoxin behandelten Platten 24 Stunden lang, bevor Sie mit dem MTT-Assay beginnen.

24 Stunden nachdem die Zellen entweder mit Fettsäuren oder Farbe behandelt wurden, wird die Lebensfähigkeit der Zellen durch den MTT-Assay bestimmt. Entfernen Sie die Lösung in jeder Vertiefung der zu testenden 96-Well-Platte und ersetzen Sie sie durch 200 Mikroliter. Eine frische Medien-Komplettlösung.

Fügen Sie jeweils 10 Mikroliter einer frisch zubereiteten MTT-Lösung von 2,5 Milligramm pro Milliliter hinzu. Inkubieren Sie die Platte drei bis vier Stunden lang bei 37 Grad Celsius. Nach drei bis vier Stunden verwerfen Sie die Medienlösung und fügen Sie jeweils 100 Mikroliter 0,04 molare Salzsäure in Isopropanol hinzu.

Inkubieren Sie die Platte fünf Minuten lang bei Raumtemperatur. Übertragen Sie anschließend die Lösung aus jeder Vertiefung eine Minute lang in eine Zentrifugenröhrchenzentrifuge bei 20.000 GS oder bis sich ein Pellet gebildet hat. Übertragen Sie zwischen 20 und 40 Mikroliter jeder Probe in einen Mikroplatten-Reader und lesen Sie die Extinktion bei 570 Nanometern mit einem Spektralphotometer ab.

Diese Abbildung zeigt das Überleben der meisten dargestellten Makrophagen in Abhängigkeit von der Positivkontrolle für Behandlungen mit steigenden Konzentrationen von Ölsäure, Linolsäure und Linolsäure. Es ist offensichtlich, dass die Zellen für keine der Fettsäuren Konzentrationen über 100 Nanogramm pro Mikroliter tolerieren. Das Experiment wurde mit menschlichen Epithelzellen für Konzentrationen von weniger als 100 Nanogramm pro Mikroliter in Schritten von 10 Nanogramm pro Mikroliter bis zu 70 Nanogramm pro Mikroliter wiederholt.

Dieses Diagramm zeigt das Überleben der Zellen für jede Konzentration von Ölsäure. Eine Möglichkeit, Inova wies darauf hin, dass einer oder mehrere der Mittelwerte statistisch unterschiedlich waren. Allerdings waren es nur die Behandlungen in höheren Konzentrationen, die statistisch andere Mittelwerte als die der Positivkontrolle ergaben.

Interessanterweise waren die beobachteten Unterschiede auf eine Zunahme der Zellviabilität mit zunehmender Variabilität zurückzuführen. Ähnliche Ergebnisse wurden für Linol- und Linolensäure erzielt. In eine Richtung.

Inova wies darauf hin, dass sich keines der Behandlungsmittel statistisch vom Mittelwert der Positivkontrolle unterschied, aber die Variabilität scheint bei einigen der höheren Konzentrationen, wie z. B. 60 Nanogramm pro Mikroliter Linolsäure oder Linolsäure, aus diesen Ergebnissen zuzunehmen. Die optimalen Fettsäurekonzentrationen bei der Verwendung menschlicher Darmepithelzellen scheinen zwischen einem und fünf Nanogramm pro Mikroliter zu liegen. Die Auswirkungen unterschiedlicher Konzentrationen von Halsbandtoxin auf das Überleben der meisten Makrophagen wurden ebenfalls mit Behandlungen für Toxinspiegel in relativ großen Schritten getestet.

Es wurde ein abnehmender Trend zur Lebensfähigkeit des Zellüberlebens beobachtet, da die erwartete Zellviabilität bei jeder Behandlung stark variierte. Die große Variabilität in der Lebensfähigkeit führte zu keinem signifikanten Unterschied zwischen dem Mittelwert der Positivkontrolle und einer der Behandlungen, was zu weiteren Tests von Toxinwerten von 100 Nanogramm oder weniger führte. Dieses Diagramm zeigt die Lebensfähigkeit der Zellen für die Behandlungen mit kleinerem Toxingehalt.

Die Zellviabilität ist für fast alle Toxinkonzentrationen sehr variabel, obwohl als Ergebnis der Behandlungen leichte Anstiege der Lebensfähigkeit beobachtet wurden. Diese Erhöhungen sind für keine der Behandlungen statistisch signifikant im Vergleich zum Mittelwert der Positivkontrolle. Basierend auf diesen Ergebnissen.

Die empfohlene Konzentration von Farbtoxin beträgt weniger als 30 Nanogramm pro Behandlung bei der Verwendung von Darm-C-Maus-Makrophagen Nach seiner Entwicklung. Diese Technik ebnete den Weg für Forscher auf dem Gebiet der Farbe oder Forschung, um zu untersuchen, ob Fettsäuren die Immunität gegen eine Infektion durch Vio-Cholera verbessern können.