Proteomik Probenvorbereitung von Formalin fixiert und in Paraffin eingebetteten Gewebe

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist die Erzeugung und Vorfraktionierung von Peptiden aus formalem und fixiertem und in Paraffin eingebettetem oder FFPE-Material für die proteomische Analyse. Dies geschieht durch Isolierung des gewünschten Gewebes durch Mikrodissektion und anschließende Zelllyse. Der zweite Schritt besteht darin, Peptide durch Probenverarbeitung zu erzeugen.

Mit Hilfe eines Multi-Enzym-Aufschlussfilters wird die Probenvorbereitung unterstützt. Die Peptide werden dann durch Messung ihrer Trytophan-Fluoreszenz quantifiziert. Der letzte Schritt ist die Fraktionierung der Peptide unter Verwendung einer auf starken Anionenaustauschern basierenden Trenntechnik für die Peptidfraktionierung.

Letztendlich ermöglichen die präparierten Proben die Analyse von Proteomen von winzigen Materialmengen bis zu einer Tiefe von 10.000 Proteinen. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden, wie z. B. beim Gel- oder Lösungsaufschluss, besteht darin, dass sie auf kleinste Mengen klinischer Proben wie z. B. Laser-Mikrodisezatorzellen anwendbar ist. Die Methode liefert Proben, die Perfektion und reine Peptide enthalten.

Was erleichtert die proteomische Erforschung von menschlichem Gewebe und Krankheiten? Das gesamte Protokoll besteht aus Techniken, die in der Vergangenheit entwickelt und veröffentlicht wurden. Dazu gehören Fasp mit hoher Rückgewinnung, Pipettenspitzenbildung und Bestimmung des Peptidgehalts auf der Grundlage von Tryptophanfluoreszenz, die zeigt, dass das Verfahren von Frau

Catina durchgeführt wird. Ein Techniker aus unserem Labor beginnt mit der Vorbereitung von Gewebeschnitten für Mikrodissektionen mit einem Mikrotom. Die Dicke der Scheiben hängt von der Probe ab. Normalerweise funktioniert die Mikrodissektion gut mit Scheiben von sieben bis 10 Mikrometern.

Nachdem Sie die Objektträger 45 Minuten lang mit UV-Licht bestrahlt haben, montieren Sie die Abschnitte darauf, bevor Sie sie zwei Stunden lang bei 37 Grad Celsius trocknen. Die montierten Abschnitte werden durch zwei aufeinanderfolgende Inkubationen in aufeinanderfolgenden Gläsern mit Xylol für zweieinhalb Minuten und eineinhalb Minuten getrennt. Rehydrieren Sie dann die Abschnitte nacheinander.

Einminütige Inkubationen in absolutem Ethanol, 70% Ethanol. Und schließlich Wasser. Nachdem die Abschnitte 20 Sekunden lang mit Meyer's Hematin gefärbt wurden.

Eine Minute lang mit Wasser abspülen und an der Luft trocknen lassen. Sammeln Sie die interessierende Zellpopulation mit einem Laser-Capture-Mikrodissektionssystem. Wenn Sie das Handflächeninstrument verwenden, entnehmen Sie die Proben in den Klebekappen mit drei Mikrolitern Gewebelysepuffer für 10 Nanoliter des Mikrodisetiergewebes.

Tragen Sie den Puffer auf das mikropräparierte Material in der Kappe auf und verschließen Sie das Röhrchen. Die Suspension wird nach einer kurzen Zentrifugation aufgefangen. Dann läuse das mikrosezierte Gewebe bei 99 Grad Celsius in einem Heizblock unter Rühren für eine Stunde.

Klären Sie den Rohextrakt durch Zentrifugation bei 16.000 g und 18 Grad Celsius für 10 Minuten. Mischen Sie bis zu 50 Mikroliter des geklärten Lysats mit 200 Mikrolitern der UA-Lösung in einer Ultrafiltrationsanlage. Dann zentrifugieren Sie bei 14.000 GS, bis weniger als 10 Mikroliter der Lösung im Filter verbleiben.

In der Regel erfordert dieser Schritt eine Zentrifugation von 10 bis 15 Minuten. Pipettieren Sie anschließend 200 Mikroliter der UA-Lösung in die Ultrafiltrationseinheit und die Zentrifuge. Entleeren Sie wie zuvor das Auffangröhrchen, bevor Sie 50 Mikroliter der IAA-Lösung in die Ultrafiltrationseinheit pipettieren.

Bei 600 U/min in einem Thermomischer bei Raumtemperatur eine Minute lang mischen und zentrifugieren. Setzen Sie die Ultrafiltrations- und Zentrifugationsschritte wie zuvor fort, wie im Textprotokoll zu diesem Video beschrieben. Übertragen Sie dann die Filtereinheiten in neue Sammelröhrchen.

Pipettieren Sie 40 Mikroliter Aufschlusspuffer mit Endoproteinase lic C, bevor Sie eine Minute lang bei 600 U/min im Thermomischer mischen. Inkubieren Sie die Geräte in einer Nasskammer bei 37 Grad Celsius für 18 Stunden. Nachdem Sie die Filtereinheiten wie zuvor zentrifugiert haben, pipettieren Sie 160 Mikroliter des DB-Puffers und zentrifugieren Sie.

Die Filtereinheiten, durch die der gepoolte Durchfluss fließt, enthalten die Peptide, die von der Endoprotease lic C freigesetzt werden. Als nächstes sammeln Sie die Triptychon-Peptide, wie im Textprotokoll beschrieben. Die Messung des Peptidgehalts in den Proteinverdauen kann in verdünntem Puffer erfolgen, da die Tryptophanreste für das Lösungsmittel gut zugänglich sind. Zur Quantifizierung von Peptiden pipettieren Sie zunächst 0,2 Milliliter des Assay-Puffers DB in den Quarz Q vet.

Setzen Sie dann den Q vet in den qve-Halter des Instruments ein und zeichnen Sie das Emissionsspektrum des Rohlings auf. Erstellen Sie eine Kalibrierkurve in Schritten von 0,1 Mikrogramm, indem Sie einen Mikroliter Aliquots der Tryptophan-Standardlösung in den Q-Tierarzt geben und vorsichtig mit dem Puffer db mischen. Nachdem Sie den Q vet gereinigt haben, pipettieren Sie die Probe und zeichnen Sie das Probenspektrum auf.

Fahren Sie mit der Berechnung der Protein- und Peptidkonzentration fort, wie im Textprotokoll beschrieben, bevor Sie fraktioniert werden. Bereiten Sie die SAX-Spitzensäule vor, indem Sie sechs Schichten EM stapeln. Import der Ionenmembran in einer gängigen 0,2-Milliliter-Pipettenspitze. Stellen Sie zwei SAX-Spitzensäulen pro Probe her.

Bereiten Sie dann die Bühnenspitze vor, indem Sie drei Lagen M vier C 18 stapeln. Machen Sie in einer 0,2-Milliliter-Pipettenspitze sechs Stufenspitzen für jede Probe. Zu Beginn.

Bei der Fraktionierung werden die durch Aufschlüsse mit ly C erhaltenen Peptidlösungen mit 0,2 Millilitern BRI und Robinson-Universalpuffer verdünnt. Bei pH 11 werden die durch Aufschlüsse mit Trypsin erhaltenen Peptidlösungen auf ähnliche Weise mit 0,2 Millilitern Britain- und Robinson-Universalpuffer verdünnt. Bei pH fünf wird die SAX-Spitzensäule vor dem Waschen in den Deckel des Zentrifugalröhrchenadapters eingebaut und die SAX-Spitzensäule und die C 18-Stufen-Spitzen wie im Textprotokoll beschrieben äquilibriert.

Montieren Sie anschließend die SAX-Spitzensäule in die C 18-Stufenspitze. Laden Sie die Probenlösungen in die äquilibrierten SAX-Spitzensäulen und zentrifugieren Sie die Säulen drei Minuten lang bei 5.000 g. Waschen Sie die Pipettenspitzensäulen mit 0,1 Millilitern der verdünnten Proben.

Erleichtern Sie den Fluss durch Zentrifugation bei 5.000 Gs.Übertragen Sie die SAX-Spitzensäule auf die nächste Spitze der C 18-Stufe und fahren Sie mit der Eluierung der Peptide fort, wie im Textprotokoll beschrieben. Nach dem Waschen der Spitzen der C 18-Stufe mit 0,05 Millilitern Puffer a eluieren die Fraktionen mit 0,05 Millilitern Puffer B in Fläschchen, die später zur Injektion der Proben in ein Flüssigchromatographiesystem verwendet werden, das mit einem Massenspektrometervertreter zusammengebaut ist. Die Ergebnisse der Proteinextraktion und -verdauung sind hier dargestellt.

Die Lyse von 250 Nanolitern Gewebe, was einer mikropräparierten Fläche von 25 Quadratmillimetern aus einer 10-Mikrometer-Scheibe entspricht, führt nach dem zweistufigen konsekutiven Verdau im Fastenformat mit Endoproteasescheibe C und Trypsin zu einer Ausbeute von mehr als 50 % des Gesamtproteins. Hier ist eine repräsentative Fluoreszenzmessung des Peptidgehalts dargestellt, die Spektren des Trytophan-Standards und die Probe zeigen Maxima bei 350 bis 360 Nanometern. Die Intensität der Fluoreszenz ist proportional zum Trytophangehalt.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie Proben aus hohem Gewebe für die proteomische Analyse mit Hilfe der Mikrodissektionstechnik, der Probenverarbeitung und der Peptidfraktionierung vorbereiten Sobald Sie diese Technik beherrschen, kann sie in drei bis vier Stunden plus einer Zeit durchgeführt werden, die für Proteinverdauungsstörungen benötigt wird. Wenn Sie dieses Verfahren versuchen, ist es wichtig, daran zu denken, frisch vorbereitete Gewebescheiben nach seiner Entwicklung zu verwenden. Diese Technik ebnete den Weg für Forscher auf dem Gebiet der Proteomik, um die Proteome von Geweben und Zellen sowie die Anomalien beim Menschen zu erforschen, indem sie Arval für in fixiertes und in Klammern eingebettetes Material verwendeten.