Testen Drosophila Riechen mit einem Y-Labyrinth-Test

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, einen einfachen Y-Labyrinth-Assay zur Verfügung zu stellen, um den Geruchssinn in der Drosophila-Melone Gaster zu testen. Dies wird erreicht, indem die Fliegen zunächst 16 bis 18 Stunden lang verhungern, damit sie motiviert sind, neue Umgebungen mit flüchtigen Reizen zu erkunden. Der zweite Schritt des Verfahrens besteht darin, das Y-Labyrinth-Setup zusammenzubauen, das die Geruchsquellen auf dem Filterpapier enthält, wie z. B. Essigsäure im Lösungsmittel im Vergleich zu Lösungsmittel allein.

Der dritte Schritt besteht darin, die Fliegen schnell und schonend in das Beladefläschchen einzuführen. Nach einigen Stunden besteht der letzte Schritt darin, die Position der Fliegen im Labyrinth zu bewerten. Letztendlich können die Ergebnisse aus den mit dem Y-Labyrinth erhaltenen Daten eine Reaktion auf den Geruchsstoff zeigen.

Wir hatten die Idee zu dieser Methode, als wir uns für eine einfache und kostengünstige Methode entschieden, um die Geruchsreaktion von Stämmen zu testen. Ein Vorteil dieser Technik gegenüber anderen Optionen besteht darin, dass sie es den Fliegen ermöglicht, eine Entscheidung zu treffen, ob zu viel Stress zu viel Stress hat. Megan Simon, eine Doktorandin aus meinem Labor, hat für dieses Protokoll eine ISO-inisierte Fliegenschnur mit stabilen, robusten Verhaltensphänotypen vorbereitet. Jeder solche Stamm dient als Referenzkontrolle für den Geruchstest, für jeden genetischen Stamm, der für das Experiment verwendet werden soll, kreuzen Sie den Stamm mit dem Referenzstamm für fünf Generationen.

Paaren Sie einzelne Versuchsstamm-Weibchen mit einigen isogenen Männchen für jede Rückkreuzung. Für olfaktorische Experimente halten Sie die Drosophila auf Standard-Maismehlmedium mit einem Antibiotikum unter 1212 Lichtzyklus. Und das bei 25 Grad Celsius.

Die Experimente sollten immer bei 25 Grad Celsius und unter Licht im fernroten Spektrum durchgeführt werden, das für Drosophila nicht sichtbar ist. Es muss auch möglich sein, den Raum zwischen den Versuchen vollständig zu lüften, bevor der Assay am nächsten Morgen durchgeführt wird. Am Ende des Tages werden Kohorten von 10 bis 20 Versuchslinien in Glasfläschchen umgefüllt, wobei die Feuchtigkeit aus einem feuchten Handtuch bereitgestellt wird.

Die Fliegen müssen innerhalb von 16 bis 18 Stunden getestet werden, sonst könnten sie am nächsten Tag an Hunger oder Hunger sterben. Baue das Y-Labyrinth zusammen. Beginnen Sie damit, den Y-förmigen Verbinder mit zwei Glasfläschchen zu verbinden, indem Sie Schaumstoffverbinder mit getrimmten Pipettenspitzen verwenden, die die Leitungen durch ihre sich verjüngende Form zu diesen Einbahngängen machen.

Der dritte Zweig des Y ist an einem Laderohr befestigt, das aus dem großen Teil einer Pipettenspitze besteht, und ermöglicht den Durchgang vom Ladefläschchen zum Auswahlpunkt des Labyrinths. Hinter jedem sich verjüngenden Tunnel befindet sich ein Glasfläschchen, von dem eines mit einer Odormittelladung beladen werden muss. Dabei handelt es sich um 40 Mikroliter Bolus, die in 28 Millimeter große Quadrate Seidenpapier eingeweicht werden.

Welche der beiden den Odorant enthält, sollte sich nach dem Zufallsprinzip abwechseln, um den Test zuerst durchzuführen. Kühl. Die fliegt kurz auf Eis, so werden die Fliegen abgebremst. Dies sollte unter dunkelrotem Licht von LED-Lampen und bei 25 Grad Celsius erfolgen, lassen Sie die Fliegenkohorte vorsichtig in das Ladefläschchen fallen und beladen Sie das Y-Labyrinth mit den Testfliegen.

Verwenden Sie keine Gasanästhesie. Es ist wirklich wichtig, die Fliegen sowohl schnell als auch schonend in das Ladefläschchen zu bringen. Es ist tatsächlich der schwierigste Schritt dieses Experiments, denn Fliegen müssen schnell aufwachen, bevor andere in der Y-Masse diffundieren.

Die Fliegen sollten das Labyrinth 24 Stunden lang erkunden dürfen, so dass sich eine maximale Anzahl an Fliegen zu dem ein oder anderen Glasfläschchen bewegt. Die Anzahl der in den verschiedenen Röhren vorhandenen Fliegen dient zur Berechnung des Geruchsindex. Auf diesen Wert, der aus dem Verhalten von bis zu 10 Fliegen gewonnen wird, sollten statistische Standardmethoden angewendet werden.

Wenn 10 Fliegenkohorten keine konsistenten Ergebnisse liefern, können die Versuche mit 20 Fliegenkohorten durchgeführt werden. Um die Labyrinth-Komponenten zu reinigen, weichen Sie sie zerlegt in RBS 35 MD über Nacht ein. Spülen Sie anschließend mit Leitungswasser und spülen Sie es abschließend mit DI-Wasser, bevor Sie an der Luft trocknen.

Standardreaktionen auf ein Odorant. Die Nutzung des Y-Labyrinths umfasst Anziehung, Gleichgültigkeit oder Vermeidung. Zum Beispiel meiden Kantone Fliegen stark 10%Essigsäure, während sie 10%Phänoessigsäure nicht meiden.

Beim Versuch dieses Verfahrens ist es wichtig, sich daran zu erinnern, dass diese Welle eine künstliche Umgebung für die Fliegen darstellt. Nach diesem Verfahren können wie bei Teamkollegen erfüllte Arena oder interne Assays durchgeführt werden, um die Geruchsreaktionen der Fliegen und die verschiedenen Bedingungen zu bestätigen. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie die Geruchsreaktionen von Filano Gaste einfach mit dem SW asay testen können.