Verwenden von Label-freien optischen Biosensoren zur Modulation von Kaliumkanälen durch G-Protein-gekoppelte Rezeptoren erkennen

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments ist es, die Modulation von G-Protein-gekoppelten Rezeptoren durch Kaliumkanäle zu detektieren, wobei optische Biosensoren zur markierungsfreien Resonanzwellenlängenbewertung verwendet werden, um dies zu erreichen. HEK 2 93-Zellen und HEK 2 93-Zellen, die stabil den Natrium-aktivierten Kaliumkanal Slack B der Ratte exprimieren, werden auf eine optische Biosensorplatte mit 384 Vertiefungen gesetzt und über Nacht inkubieren gelassen. Als nächstes wird eine Basismessung der Masse in der Nähe der Plasmamembran durchgeführt und Agonisten endogener G-Protein-gekoppelter Rezeptoren oder G-PCRs werden hinzugefügt. In einem letzten Schritt wird die Signaländerung, die sich aus der GPCR-Aktivierung ergibt, gemessen und die Kaliumkanalmodulation dieser Reaktion berechnet.

Letztendlich kann diese Methode dazu beitragen, Schlüsselfragen in den Bereichen Neurowissenschaften und zelluläre Signalübertragung zu beantworten, indem sie die Signalmechanismen zwischen G-Protein-gekoppelten Rezeptoren und Kaliumkanälen quantitativ misst. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber den derzeit bestehenden Methoden zur Untersuchung der Wechselwirkungen zwischen Kanälen und Proteinen, z. B. CO- und Fällungsassays, besteht darin, dass der Assay mit lebenden Zellen durchgeführt werden kann. Es ist nicht erforderlich, exogene Markierungen zu verwenden, die die Struktur des interagierenden Proteins verändern könnten.

Und schließlich kann man innerhalb der lebenden Zellen die Wechselwirkungen tatsächlich in Echtzeit verfolgen. Diese Methode kann jedoch einen Einblick in die Signalübertragung zwischen GPCRs und Kaliumkanälen geben. Es kann auch verwendet werden, um zelluläre Reaktionen zu untersuchen, die sich aus ligandeninduzierten Veränderungen der Zelladhäsion und -ausbreitung, Toxizität, Proliferation, Migration und Änderungen in der Nähe der Plasmamembran zum optischen Biosensor ergeben.

Die Technik hat auch das Potenzial, bei der Entdeckung neuer therapeutischer Ansätze für Krankheiten eingesetzt zu werden, die durch Ionenkanäle oder Rezeptoranomalien verursacht werden, wie z. B. viele Kanalopathien, da sie als Hochdurchsatzmethode verwendet werden kann, um die Auswirkungen pharmakologischer Wirkstoffe auf Kanalproteine zu testen. Wechselwirkungen zwischen Proteinen. Wir hatten die Idee, diese Methode zu verwenden, als wir erkannten, dass es notwendig war, einen Assay zu entwickeln, der die Wechselwirkungen von Kanalproteinen in lebenden Zellen untersuchen kann.

Beginne 384. Beschichtung der optischen Biosensorplatte durch Hydratisierung einer Titandioxidplatte mit 20 Mikrolitern steriler Gewebekultur pro Vertiefung und 15 Minuten lang Wasserqualität. Verwenden Sie dann eine 16-Kanal-Pipette, um die Platte einmal mit 50 Mikrolitern phosphatgepufferter Kochsalzlösung oder PBS pro Vertiefung zu waschen.

Als nächstes fügen Sie 20 Mikroliter einer vorbereiteten Fibronektin-Arbeitslösung in jede Vertiefung hinzu, bevor Sie zwei Stunden lang bei Raumtemperatur inkubieren, um nach der Inkubation die extrazelluläre Matrix oder EZM zu erzeugen. Waschen Sie die Platte einmal mit 50 Mikrolitern PBS pro. Nun, dann fügen Sie jedem 40 Mikroliter einer vorbereiteten Eieralbumin-Arbeitslösung hinzu.

Inkubieren Sie die Platte über Nacht bei vier Grad Celsius, um die Platte nach der Ovalbuminbindung zu blockieren. Waschen Sie die Platte dreimal mit 50 Mikrolitern PBS pro Mulde. ECM-beschichtete Platten können bis zu vier Stunden lang bei vier Grad Celsius gelagert werden.

Das Wachstumsmedium wird sowohl von nicht resezierten HEK 2 93-Zellen als auch von HEK 2 93-Zellen, die stabil Slack B exprimieren, entfernt, die wie im Textprotokoll beschrieben kultiviert wurden. Fügen Sie dann Tripsin hinzu, um die Zellen von der Platte zu lösen. Sammeln Sie die Zellen eine Minute lang in einer Zentrifuge bei 1000-facher Schwerkraft.

Entfernen Sie die Tripsin Medium und resuspendieren Sie die Zellen im Wachstumsmedium. Bestimmen Sie mit einem Hämozytometer oder einem automatisierten Zellzähler die Konzentration der Zellen, um die Auswirkungen der Verdunstung während der Inkubation zu minimieren, verdünnen Sie die Zellen, um die gewünschte Anzahl von Zellen pro Vertiefung zu erreichen. In einem Volumen von 50 Mikrolitern Wachstumsmedium für diese Experimente 1000 Zellen pro Well.

Nachdem 50 Mikroliter der verdünnten Zellen auf den Biosensor pipettiert wurden, konnten die sitzenden Zellen über Nacht in Wachstumsmedium bei 37 Grad Celsius, 5 % CO2, inkubiert werden. Zur Vorbereitung des Resonanzwellenlängen-Gradings oder des optischen RWG-Biosensor-Assays. Entfernen Sie das Wachstumsmedium nach der Inkubation aus den Zellen.

Waschen Sie die Zellen einmal mit der ausgewogenen Salzlösung von Hank und fügen Sie dann jeweils 25 Mikroliter der Lösung hinzu. Platzieren Sie die Biosensorplatte gut auf dem Bind-Scanner und lassen Sie die Zellen ein bis zwei Stunden lang auf Raumtemperatur äquilibrieren. Bereiten Sie in der Zwischenzeit eine separate Verbindungsplatte vor, von der aus die interessierenden Liganden während des Assays zur Biosensorplatte hinzugefügt werden.

Für diese Assays wurden 25 Mikroliter lösungshaltige Verbindung in jede Vertiefung auf der Biosensorplatte gegeben, was ein Gesamtvolumen von 50 Mikrolitern ergibt. Um den optischen RWG-Biosensor-Assay durchzuführen, führen Sie mit dem Scannersystem eine Basismessung für die Vertiefungen A eins bis P 12 durch, die die Hälfte der 384 darstellen. Die Well-Platte verwendet eine maximale Auflösung von 3,75 Mikrometern pro Pixel für die zentralen 1,5 Millimeter jedes Wells mit der Bind-Scan-Software, dieser Baseline-Scan dauert etwa 30 Minuten.

Geben Sie dann 25 Mikroliter der Verbindungslösungen in jede Vertiefung für Vertiefungen, eine Eins bis P 12. Als nächstes wird eine Basismessung der Vertiefungen A 13 bis P 24 durchgeführt. Entsprechend der Grundlinie dieser Vertiefungen werden 25 Mikroliter der Verbindungslösungen in jede Vertiefung A 13 bis P 24 gegeben.

Als letzten Schritt nehmen Sie eine Nachverzinsungsmessung für die Vertiefungen A eins bis P 12 vor und wiederholen Sie die Messung für die Vertiefungen a 13 bis P 24. Um die Assay-Daten zu analysieren, öffnen Sie die Bind-Assay-Daten für die Baseline-Messung in Fenstern und klicken Sie auf die Schaltfläche des Rastereditors, um die Zellauswahl zu aktivieren. Die Software berechnet die vom Benutzer definierten Metriken von Interesse, öffnet die Plugins, die den Zellfinder und die Baseline- oder Funktionseinstellungsparameter im Zellfinder enthalten, so dass die Zellen vom Hintergrund des Biosensors unterschieden werden können.

Exportieren Sie die Zellzuordnungsdatei, die die Zellfinderdaten für die Basislinienmessung enthält. Wiederholen Sie diese Schritte für Daten nach der Aufzinsung. Öffnen Sie dann die Baseline oder das Plugin und importieren Sie die Zellenkarte aus der Baseline-Messung.

Die Software berechnet die Verschiebung des Peak-Wellenlängenwerts (PWV) zwischen den Hintergrund- und Post-Compound-Daten. Wählen Sie den Delta-Zellenmittelwert für die Ausgabe der mittleren Verschiebung der PWV für Zellen aus. Die Daten können dann zur weiteren Analyse nach Microsoft Excel exportiert werden.

Slack b stabil transfiziert, HEK 2 93. Zellen und nicht resezierte HEK 2 93-Zellen wurden bei 1000 Zellen pro Well auf 384 gesetzt. Nun, ECM-beschichtete RWG-Biosensorplatten und Dichtegradientenkarten der Masse wurden vor und 30 Minuten nach der Wirkstoffausgabe mit dem Bind-Scan erstellt.

Die rot dargestellten Softwarebereiche stellen Pixel dar, die als zu Zellen gehörend identifiziert wurden, und gelbe Linien, die Zellen vom grauen Plattenhintergrund unterscheiden. Die Bind-View-Software wurde verwendet, um die Verschiebung der PWV auf die GPCR-Agonisten-Edition zu bestimmen, indem die PWV-Post-Compound-Edition von der PWV-Ausgangs-PWV subtrahiert wurde. Dies wird durch einen Farbverlauf angezeigt, wobei Rot eine positive Verschiebung des Spitzenwellenlängenwerts darstellt und Blau keine Änderung darstellt.

Der endogene M1-Muskarinrezeptor gegen Carbahol wurde sowohl an nicht resezierten Kontrollzellen HEK 2 93 als auch an HEK 2 93 Zellen appliziert, die stabil Slack B exprimieren, und führte zu einem positiven Anstieg des maximalen Wellenlängenwertes im Vergleich zu den Kontrollzellen. Die schlaffen B-transfizierten Zellen wiesen einen stärkeren Anstieg des Spitzenwellenlängenwerts auf. S-F-L-L-R NH zwei, Trifluoracetatsalz und endterminales Thrombinrezeptor-aktivierendes Peptid Pentapeptid, das Agonistenaktivität gegen den endogenen GPCR-Protease-aktivierten Rezeptor zeigt, zeigte ebenfalls unterschiedliche Reaktionen in nicht resezierten und schlaffen B-transfizierten Zellen.

Diese Ergebnisse zeigen, dass das Vorhandensein des Slack-B-Kanals die Verschiebung des PWV, die nach Aktivierung der endogenen G-PCR in den K-Zellen auftritt, signifikant erhöht, und zeigen die Machbarkeit der Verwendung dieses Assays zur Untersuchung von Kanalproteininteraktionen. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie einen markierungsfreien optischen Biosensor-Assay entwickeln und durchführen. Sobald diese Technik gemeistert ist, kann sie im Laufe von zwei Tagen durchgeführt werden, wenn die Zellen und Reagenzien bei diesem Verfahren sorgfältig vorbereitet wurden.

Es ist wichtig, sich daran zu erinnern, dass Assay-Parameter, wie z. B. die Anzahl der zu sitzenden Zellen, die Inkubationszeit von Liganden usw., für verschiedene Zelllinien optimiert werden müssen. Sobald Sie dieses Verfahren durchgeführt haben, können Sie mit anderen Methoden wie R und AI versuchen zu bestimmen, welche speziellen Proteine für die beobachtete Änderung des Signals erforderlich sind. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit menschlichen Zellkulturen äußerst gefährlich sein kann und bei der Durchführung dieses Verfahrens immer Vorsichtsmaßnahmen wie die Arbeit in einer Biosicherheitshaube getroffen werden sollten.