Ein fluoreszierendes Screening Assay zur Identifizierung von Modulatoren der GIRK Kanäle
24. April 2012
Ein Echtzeit-Screening-Verfahren zur Identifizierung von Medikamenten, die mit G-Protein-gated Einwärtsgleichrichter K interagieren + (GIRK) Kanälen beschrieben. Der Test basiert Membranpotential Fluoreszenzfarbstoffe zu GIRK Kanal-Aktivität zu messen. Diese Technik eignet sich sowohl für den Einsatz auf einer Reihe von Zelllinien.
Das allgemeine Ziel dieses Verfahrens besteht darin, neue Wirkstoffe zu identifizieren, die GRK-Kanäle modulieren. Dies wird zunächst erreicht, indem die A TT 20-Zellen in die 96-Loch-Platte ausgesät werden. Der zweite Schritt besteht darin, die Testverbindungen mithilfe des Verset-Flüssigplatten-Manipulationssystems zu verdünnen.
Anschließend werden die verdünnten Testsubstanzen mit dem Verset auf die Zellen aufgetragen. Im letzten Schritt wird die 96-Well-Platte in den fluoreszenzbasierten Plattenreader Synergy zwei eingelegt, und die Kontroll- sowie Somatostatin-Lösungen werden in die Vertiefungen injiziert. Abschließend dient der fluoreszenzbasierte Plattenreader dazu, die Substanzen zu identifizieren, die das somatostatininduzierte Fluoreszenzsignal verändern und somit die Grk-Kanäle modulieren.
Der Vorteil dieses Verfahrens im Vergleich zu bestehenden Methoden wie der Patch-Clamp-Aufzeichnung besteht darin, dass eine große Anzahl von Verbindungen schnell darauf untersucht werden kann, ob sie Gerk-Kanäle modulieren. Die Bedeutung dieser Technik reicht bis zur Schmerztherapie, da Verbindungen identifiziert werden können, die den Gerk-Kanal aktivieren und dadurch die nozizeptive Übertragung im FI-System hemmen. Demonstration des Verfahrens zum Beschichten der 96-Loch-Platten und zum Aussäen der Zellen durch Maribel Vasquez.
Ein Student in meinem Labor beginnt dieses Verfahren, indem er die Hypophysen-ACTH-20-Zellen in DMEM kultiviert, das mit 10 % Pferdeserum ergänzt ist, bei 37 Grad Celsius in einer befeuchteten Atmosphäre mit 5 % CO2. Pflegen Sie die Kultur, indem Sie die Zellen alle fünf bis sieben Tage mit einem Standardverfahren unterkultivieren. Beschichten Sie anschließend die Vertiefungen der schwarzen klaren Platte.
Untere 96-Loch-Platte mit 50 µL Poly-L-Lysin. Die Platte 30 Minuten im Inkubator trocknen lassen. Anschließend überschüssiges Poly-L-Lysin entfernen und die Zellen in der 96-Loch-Platte mit 200 µL Medium bei einer Dichte von 30.000 Zellen pro Loch ansäen.
Anschließend die Zellen drei bis vier Tage lang im Inkubator lagern. Unter Verwendung einer Absaugvorrichtung das Kulturmedium langsam von der Zellmonoschicht absaugen und die Zellen anschließend mit 200 Mikroliter normaler Pufferlösung waschen. Danach jeweils 200 Mikroliter Pufferlösung zugeben, die den membranpotentialsensitiven Farbstoff enthält.
Inkubieren Sie die Zellen 40 Minuten lang bei 37 Grad Celsius. Nach 40 Minuten nehmen Sie die A TT 20-Zellen aus dem Inkubator, lassen Sie sie auf Raumtemperatur zurückkehren und aspirations die alte Pufferlösung. Anschließend geben Sie frische Pufferlösung, die MPD enthält, zu den Zellen hinzu.
Als Nächstes verwenden Sie das Flüssigkeitsmanagementsystem, um verschiedene Konzentrationen der Testverbindungen und Kontrolllösungen auf die Zellen aufzutragen. Inkubieren Sie die Zellen in der 96-Loch-Platte fünf Minuten lang mit den Testverbindungen vor den Fluoreszenzmessungen. Führen Sie in diesem Verfahren die 96-Loch-Platte einem fluoreszenzbasierenden Mikroplattenreader des Typs Biotech Synergy Two zu.
Bestimmen Sie das fluoreszierende Hintergrundsignal bei einer Exzitationswellenlänge von 520 Nanometern und einer Emissionswellenlänge von 560 Nanometern. Anschließend geben Sie die G-PCR-R-Liganden oder die Kontrolllösung mithilfe des Synergy-Zwei-Injektor-Systems in die Vertiefungen, um die GIR-Kanäle zu aktivieren. Danach erfassen Sie die Messpunkte im Abstand von zehn Sekunden über einen 302. Stichprobenzeitraum.
Bei den Anregungs- und Emissionswellenlängen. Berechnen Sie den Z-Faktor, um die Zuverlässigkeit des Assays zu bestimmen. Z-Faktoren im Bereich von 0,5 bis 1,0 zeigen an, dass die Qualität des Assays ausgezeichnet ist.
Platten mit Z-Faktoren unterhalb von 0,5 werden ausgeschlossen. Aus der Analyse heraus werden Verbindungen, die das Fluoreszenssignal modulieren, erneut in Gegenwart von zwei Millimolar Bariumchlorid oder 500 Nanomolar Terapin Q getestet, um die Spezifität für den inward-rectifier-Kaliumkanal zu bestätigen. Hier ist ein repräsentatives HLB 0 2 1 1 15 2-Fluoreszenssignal über die Zeit in den A TT 20-Zellen nach Zugabe von Somatostatin oder einer Kontrolllösung dargestellt. Das Verhältnis der Fluoreszenzintensität auf der Y-Achse wurde berechnet, indem das Signal in Gegenwart von Somatostatin oder der Kontrolllösung durch das Baselinesignal vor der Zugabe von Somatostatin oder der Kontrolllösung dividiert wurde.
Hier gezeigt ist die Behandlung der A TT 20-Zellen mit 500 Nanomolar. Terapin Q hemmt die durch Somatostatin vermittelte Abnahme des Fluoreszenzsignals, indem es an zwei Stellen bindet und die G-Kanäle blockiert. Und hier gezeigt ist die Behandlung der A TT 20-Zellen mit 20 Mikromolar Propafenon, das ebenfalls die durch Somatostatin vermittelte Abnahme des Fluoreszenzsignals hemmt. Wenn die Technik einmal beherrscht ist, kann sie bei korrekter Durchführung innerhalb von zwei Stunden durchgeführt werden.
Nach der Betrachtung dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man Wirkstoffe identifiziert, die GRK-Kanäle mithilfe eines fluoreszenzbasierten Plattenlesegeräts modulieren.
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Übersicht
Dieser Artikel beschreibt ein Echtzeit-Screening-Verfahren zur Identifizierung von Wirkstoffen, die mit G-Protein-gesteuerten inward-rectifier-K+-Kanälen (GIRK) interagieren. Der Test verwendet fluoreszierende Farbstoffe, die empfindlich auf das Membranpotenzial reagieren, um die Aktivität von GIRK-Kanälen zu messen, und ist daher für verschiedene Zelllinien anwendbar.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Pharmakologie
- Neurowissenschaft
- Elektrophysiologie
Hintergrund
- GIRK-Kanäle spielen eine entscheidende Rolle bei der neuronalen Signalübertragung.
- Die Identifizierung von Modulatoren der GIRK-Kanäle kann zu neuen therapeutischen Strategien führen.
- Echtzeit-Assays steigern die Effizienz der Wirkstoff-Screening-Verfahren.
- Fluoreszierende Farbstoffe ermöglichen eine empfindliche Messung der Kanalaktivität.
Zweck der Studie
- Eine Methode zur Untersuchung von Wirkstoffen, die GIRK-Kanäle modulieren, entwickeln.
- Eine Hochdurchsatz-Plattform zur Prüfung mehrerer Verbindungen nutzen.
- Das Verständnis der Pharmakologie von GIRK-Kanälen verbessern.
Verwendete Methoden
- Plattieren von A TT 20-Zellen in einer 96-Loch-Platte.
- Verdünnen von Testsubstanzen mit dem Verset-Liquid-Handling-System.
- Auftragen der verdünnten Substanzen auf die Zellen mittels Verset.
- Messen der Reaktionen mit einem Synergy Two-Fluoreszenz-Plattenreader.
Hauptergebnisse
- Identifizierung von Verbindungen, die somatostatininduzierte Signale verändern.
- Nachweis der Anpassungsfähigkeit des Assays an verschiedene Zelllinien.
- Erfolgreiche Modulation der GIRK-Kanalaktivität durch getestete Verbindungen.
- Validierung der Effektivität des fluoreszenzbasierten Plattenlesegeräts im Screening.
Schlussfolgerungen
- Der entwickelte Test ist ein wertvolles Werkzeug für die Arzneimittelforschung, die auf GIRK-Kanäle abzielt.
- Mittels Echtzeit-Screening kann die Identifizierung potenzieller Therapeutika beschleunigt werden.
- Weitere Studien sind erforderlich, um die klinischen Auswirkungen der identifizierten Verbindungen zu untersuchen.
Häufig gestellte Fragen
Ausführliche Bedeutung für die Industrie
Dieser Test ermöglicht die Hochdurchsatz-Identifizierung von GIRK-Kanal-Modulatoren und unterstützt die Target-Validierung in der neurowissenschaftlichen und kardiovaskulären Wirkstoffforschung. Durch die Bereitstellung von Echtzeit-Fluoreszenzdaten in quantitativer Form verringert er die Abhängigkeit von niedrigdurchsatzfähiger Elektrophysiologie und beschleunigt den Übergang von Hits zu Leitstrukturen. Die Methode erhöht die Vorhersagesicherheit in der frühen Entdeckungsphase, indem sie die Wirkstoffeffekte mit der funktionellen Kanalaktivität in einem physiologisch relevanten zellulären Kontext verknüpft.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Wissenschaftlicher Wert: Überprüft therapeutische Hypothesen, indem die funktionelle Modulation von GIRK-Kanälen als Reaktion auf GPCR-Liganden gemessen wird.
- Operationaler Wert: Ermöglicht die schnelle Durchmusterung von Substanzbibliotheken, um Aktivatoren oder Inhibitoren mit mechanistischer Spezifität zu identifizieren.
- Prädiktiver Wert: Unterstützt die Absicherung von Zielstrukturen, indem die Wirkung am Ziel durch Änderungen des Fluoreszenzsignals bestätigt wird, die mit K⁺-Efflux korrelieren.
Screening und Assay-Entwicklung
- Assay-Bereitschaft: Verwendet membranepotenzial-sensitive Farbstoffe (DiBAC4(3) oder HLB 021-152), um bei GIRK-Aktivierung quantifizierbare, Echtzeitsignale zu erzeugen.
- Reproduzierbarkeit: Die Berechnung des Z-Faktors (ausgezeichneter Bereich: 0,5–1,0) gewährleistet die Robustheit des Assays für die Trefferselektion und die Reproduzierbarkeit von Kampagnen.
- Skalierbarkeit: Kompatibel mit 96-Well-Format und Flüssigkeitsmanagementsystemen (z. B. Verset) für die automatisierte Substanzdosierung und -screening.
Translationale und präklinische Forschung
- Krankheitsrelevanz: Identifizierte Modulatoren könnten therapeutische Strategien bei neuropathischen Schmerzen, Suchterkrankungen und Herzrhythmusstörungen über die GIRK-vermittelte neuronale Hemmung beeinflussen.
- Translationale Kontinuität: Fluoreszenzsignale ermöglichen den Übergang von der Zielstrukturenbindung zur funktionellen Wirkung und unterstützen die Verankerung präklinischer Phänotypen.
- Mechanistische Ent风险bewertung: Die Spezifität wird mithilfe von Inhibitoren wie Bariumchlorid oder Terapin Q bestätigt, um GIRK-vermittelte Effekte von Wirkungen am falschen Ziel zu unterscheiden.
Pipeline- und Workflow-Integration
Der Test fügt sich in die Entdeckungskette von der Target-Validierung bis zur Leitstruktur-Identifizierung ein und ermöglicht die funktionelle Bildschirmuntersuchung von GIRK-Modulatoren vor der nachgeschalteten Optimierung.
- Entdeckungsbiochemie: Unterstützt die Hypothesenprüfung, indem sie die Aktivierung von GPCRs mit GIRK-abhängigen Fluoreszenzänderungen verknüpft und so die Modulation des Signalwegs aufklärt.
- Screening: Ermöglicht die Bereitschaft für Assays durch standardisierte Farbstoffbeladung, Applikation von Verbindungen und kinetische Messung der Fluoreszenz über 300 Sekunden.
- Analytik: Erzeugt quantitative abhängige Variablen (Fluoreszenzintensitätsraten), die den Vergleich von Wirksamkeit und Potenz der Verbindungen ermöglichen.
- Translationale Forschung: Knüpft an präklinische Arbeiten an, indem sie Verbindungen identifiziert, die die neuronale Erregbarkeit über GIRK beeinflussen, was für Schmerz- und Suchtmodelle relevant ist.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Plattformübergreifend anpassbar auf verschiedene Zelllinien und GPCR-Liganden, wodurch die Wiederverwendung in mehreren Kampagnen zur Zielvalidierung gefördert wird.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Bietet eine vorhersagbare Sicherheit hinsichtlich der Zielmodulation, indem mechanistische Unklarheiten bei der Ionenkanal-Wirkstoff-Screening reduziert werden.
- Operativer Wert: Bietet Standardisierung, Reproduzierbarkeit und Echtzeit-Kinetikdaten, die mit Endpunkt-Assays nicht erreichbar sind.
- Strategischer Wert: Verbessert Entscheidungen über Fortsetzung oder Abbruch, indem eine frühe funktionelle Validierung ermöglicht wird, wodurch das Risiko später Fehlschläge aufgrund fehlender Zielinteraktion verringert wird.
- Portfolio-Implikation: Ermöglicht eine risikoadjustierte Priorisierung von Verbindungen mit nachgewiesener GIRK-Aktivität für die Weiterentwicklung zur Lead-Optimierung.
Durchführungsaspekte
- Erfordert Fachkenntnisse in Zellkultur (AT T20-Zellen), Umgang mit fluoreszierenden Farbstoffen und Bedienung eines kinetischen Plattenlesegeräts.
- Benötigt ein Fluoreszenz-Plattenlesegerät mit Injektionsfunktion (z. B. Synergy 2) und kompatiblen Anregungs-/Emissionswellenlängen (520 nm/560 nm).
- Erfordert die Standardisierung der Farbstoffbeladung, Inkubationszeiten und Pufferbedingungen über alle Vertiefungen und Platten hinweg.
- Die Anpassung an andere Zelllinien erfordert die Validierung der GIRK-Expression und der Effizienz der Farbstoffaufnahme.
- Praktische Einschränkung: Die Spezifität des Assays muss mithilfe orthogonaler Inhibitoren (z. B. Ba2+, Terapin Q) bestätigt werden, um fluoreszenzänderungen, die nicht durch GIRK vermittelt sind, auszuschließen.
