Subtyp-selektive Elektroporation kortikaler Inter

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, interne Neuronen im sich entwickelnden vierten Gehirn der Maus mittels In-utero-Elektroporation zu erreichen. Dies wird erreicht, indem zunächst die Injektionsnadeln vorbereitet werden. Der zweite Schritt besteht darin, die embryonale Kette vom anästhesierten Tier zu entfernen.

Dann werden DNA-Injektion und Elektroporation im Gehirn durchgeführt. Der letzte Schritt besteht darin, dem Tier zu ermöglichen, sich von der Operation zu erholen. Letztendlich wird in utero die Elektroporation verwendet, um ein selektives Targeting von Interneuronen-Subtypen zu ermöglichen.

Der Vorteil dieser Methoden unserer bestehenden Techniken, es ist wie die unspezifische in utero Elektrooperation, dass sie die Möglichkeit bietet, eine zellautonome Analyse einer Untergruppe von kortikalen Interneuronen durchzuführen. Die hohen Niveaus der GFP-Expression ermöglichen die Visualisierung und Analyse einzelner inter. Diese Methode kann helfen, grundlegende Fragen im Bereich der neurologischen Entwicklung zu beantworten, wie z.B. welche Regeln für die Integration der Reifung untereinander gelten.

Um diesen Vorgang zu starten, bereiten Sie die Mikroinjektionspipette vor, indem Sie mit einem Pipettenabzieher an einer Glaskapillare ziehen. Entfernen Sie anschließend vorsichtig die Kapillare und sammeln Sie die untere Nadel für die Mikroinjektion. Lege nun eine betäubte schwangere Maus mit der Bauchseite nach oben auf das Heizkissen.

Decken Sie sein Schicksal mit einer Maske ab, die während der gesamten Operation weiterhin Fluor liefert. Tragen Sie dann Augengleitmittel auf beide Augen auf. Stellen Sie das Heizkissen auf 36 Grad Celsius ein, um eine Unterkühlung danach zu vermeiden.

Überprüfen Sie, ob keine Fuß- und Schwanzreflexe vorhanden sind, indem Sie die Hinterpfoten oder den Schwanz einklemmen. Reinigen Sie anschließend die Haut am Bauch mit 70% Ethanol. Ziehe die Haut mit einer Pinzette nach oben.

Machen Sie dann einen zwei Zentimeter kleinen vertikalen Schnitt entlang der Mittellinie, der auf halbem Weg zwischen dem dritten und vierten Paar der Brustdrüsen beginnt. Achten Sie darauf, die Bauchdecke nicht mit runden Pinzetten zu beschädigen. Ziehen Sie die embryonale Kette vorsichtig aus der Kavität weg.

Lassen Sie die Kette auf den Feuchttüchern ruhen. Beginnen Sie damit, eine Hälfte der Gebärmutter freizulegen. Fahren Sie dann mit der Elektroporation der Embryonen fort, bevor Sie zur anderen Hälfte übergehen.

Bei diesem Verfahren wird die DNA-Lösung hergestellt, indem das aus einem Standard-Maxi-Prep-Reinigungsprotokoll gewonnene Pellet in destilliertem Wasser aufgelöst wird. Fügen Sie dann der DNA-Lösung schnelles Grün im Verhältnis eins zu 20 hinzu, um eine Visualisierung während der Injektion zu ermöglichen. Schneiden Sie als Nächstes die Spitze einer vorgezogenen Mikropipette mit einer feinen Pinzette so ab, dass vom Anfang der Schulter bis zum Ende der Spitze sechs Millimeter übrig bleiben.

Laden Sie anschließend die Mikropipette mit einem Mikroliter DNA-Lösung mit Fast Green für die Injektion. Halten Sie den Kopf des Embryos mit einer runden Pinzette fest. Führen Sie die Pipette in einem Winkel von 45 Grad in das Gehirn ein und zielen Sie dabei auf den lateralen Ventrikel, der sich in der Nähe der Mittellinie befindet.

Wenn die Nadel durch den Ventrikel eindringt, ziehen Sie die Pipette langsam zurück. Der Ventrikel sollte grün werden, wenn die Lösung beginnt, ihn zu füllen. Hören Sie an diesem Punkt auf, die Pipette zu bewegen, und injizieren Sie einen Mikroliter DNA.

Ziehen Sie dann die Pipette vorsichtig heraus. Stellen Sie den ECM-Achtzylinder 30 auf 5 45-Volt-Impulse von 50 Millisekunden im Abstand von 950 Millisekunden ein. Tauchen Sie die fünf Millimeter langen Paddelelektroden in PBS, um eine effiziente Stromübertragung zu gewährleisten.

Platzieren Sie dann die Elektrodenpaddel um den Kopf des Embryos mit einem positiven Paddel auf dem Ventrikel, der die DNA-Lösung enthält. Platzieren Sie das positive Paddel etwas tiefer als das negative, um eine ventrale Strömung durch die ganglionären Eminenzen zu erzeugen. Dadurch wird die ektopische Expression in Parametallzellen minimiert.

Geben Sie nun einen Impuls ab, indem Sie das Fußpedal einmal betätigen, entfernen Sie dann die Elektroden und wischen Sie sie sauber. Wiederholen Sie die Schritte für jeden der Embryonen. Nach dem Elektro per aller Embryonen.

Gießen Sie drei Milliliter PBS in die Bauchhöhle und bringen Sie die Embryonen in die Bauchhöhle zurück. Als nächstes nähen Sie die Bauchdecke mit einer gebogenen Nadel und fünf Oh Seidennaht und dann die Haut. Tragen Sie Lidocain auf die Wunde auf und verabreichen Sie zunächst 120 Milligramm pro Kilogramm Aspirin zur Analgesie.

Nehmen Sie das Tier aus dem Anästhesieschlauch und lassen Sie es auf einem Papiertuch auf dem Heizkissen erholen. Danach bringen Sie das Tier wieder in den Käfig zurück. Halten Sie es auf dem Heizkissen bei 37 Grad Celsius und überwachen Sie den Gesundheitszustand.

In diesem Experiment werden elektroporierte Interneuronen durch die Expression von CGE E abgeleiteten Subtyp-Markern abgegrenzt. Dieses Bild zeigt, dass die CGE-abgeleiteten Interneuronen mit einem DLX fünf sechs EGFP-Plasmid elektroporiert sind. Dieses Bild zeigt ein VIP, das Interneuron bei P acht exprimiert.

Die EGFP-Expression beschreibt den gesamten dendritischen Baum und den axonalen Dorn einzelner Neuronen, und hier ist ein NPY-exprimierendes Interneuron bei P acht. Die NP y-Expression grenzt Neuroglia von Zellen ab. Zuletzt ist hier ein NPY, das Interneuron bei P 15 exprimiert.

Einmal gemeistert, kann diese Technik in 20 Minuten durchgeführt werden, wenn sie richtig ausgeführt wird. Durch die Kombination der Verwendung von spezifischem Plasmid und genetisch veränderten Mauslinien ist es möglich, eine zeitliche und spezielle Kontrolle bei der Expression von Genen von Interesse zu erreichen. In einigen Experimenten verwenden wir das A-D-L-X-T-T-A-Plasmid, um die Expression von AU-abhängigen Transgenen zu induzieren.

In diesen Experimenten haben wir die stille Expression des Transgens durch Verabreichung von Doxycyclin gemessen.