Generation of Human Fettgewebestammzellen durch Dedifferenzierung der Reife Adipozyten in Decken Kulturen
7. März 2015
Reife Adipozyten können durch Dedifferenzierung eine reichhaltige Quelle für Stammzellen darstellen, was zu einer homogenen Population von Fibroblasten-ähnlichen Zellen führt. Der Kollagenaseverdau wird verwendet, um reife Adipozyten aus menschlichem Fett zu isolieren. Das Ziel unseres Protokolls ist es, multipotente, dedifferenzierte Fettzellen aus humanen reifen Adipozyten zu gewinnen.
Reife Depos haben die Fähigkeit, D in vitro in Vorläuferzellen zu differenzieren. Dies wird durch Siegelkultur erreicht, eine Technik, bei der reife Zellen in einem Kolben kultiviert werden, der vollständig mit Medien gefüllt und auf dem Kopf stehend kultiviert wird. Die schwimmenden Zellen haften an dem Kolben und ändern ihre Morphologie, indem sie von einer runden, mit Lipiden gefüllten Zelle zu einer länglichen, fibroblastenartigen Zelle übergehen. Gleichartig.
Populationen von länglichen Zellen können nach Erhalt von Gewebeproben im Labor gewonnen und geheilt werden. Wiegen Sie das Fettgewebe, je nach Anzahl der benötigten Adipozyten, und geben Sie ein entsprechendes Probenvolumen in ein 50-ml-Getränk. Zwei für die Verdauung können Sie damit rechnen, etwa 1 Million Zellen pro Gramm Gewebe zu erhalten.
Deckenkulturen werden mit 500.000 Zellen pro 25-Zentimeter-Kolben und 50.000 Zellen für jede Vertiefung einer Sechs-Well-Platte durchgeführt, geben Sie KRH-Arbeitspuffer hinzu, der mit Kollagenase ergänzt wird, zerkleinern Sie das Gewebe mit einer Schere und inkubieren Sie die Zubereitung bei 37 Grad Celsius für 45 Minuten. Bereiten Sie während der Inkubation den Schlauch und die Spritze vor. Gieße die durchscheinende Lösung durch ein Nylonnetz mit einer Pinzette in ein Plastikbecherglas.
Reiben Sie das Zellpräparat durch das Netz und waschen Sie es mit fünf ml KRH Arbeitspuffer sanft. Übertragen Sie die filtrierte Zellsuspension in ein 50-ml-Set mit Röhrchen und Spritze. Lassen Sie uns reife Adipozyten etwa 10 Minuten lang stehen lassen.
Die Zellen erreichen durch Flotation die Oberseite des Puffers. Saugen Sie den Puffer langsam von unten an. Fügen Sie mit einer Spritze und einem Schlauch 20 ml KRH-Arbeitspuffer zum Waschen hinzu.
Wiederholen Sie die Waschschritte zweimal. Sammeln Sie den Puffer, um die Adipozytensuspension auf ein Endvolumen von fünf ml zu bringen, und fahren Sie mit der Zählung der Zellen mit einem Hämozytometer fort, füllen Sie einen T 25-Kolben zu drei Vierteln seines Volumens mit D-M-E-M-F 12, ergänzt mit 20%igem Kälberserum, übertragen Sie 500.000 reife Adipozyten in den Kolben. Füllen Sie den Kolben mit dem Medium auf und entfernen Sie die Luftblasen von der Oberseite.
Schrauben Sie eine erfundene Kappe auf den Kolben. Inkubieren Sie den Kolben eine Woche lang kopfüber in einem Zellkultur-Inkubator mit 5 % Kohlendioxid. Vermeiden Sie Bewegungen des Kolbens, da verbleibende Blasen die Zelladhärenz stören können.
Legen Sie einen Deckzettel auf den Boden der Vertiefungen. Geben Sie die Kunststoffbuchse in die Vertiefung und füllen Sie die Vertiefung mit acht ml Medien. Stellen Sie sicher, dass keine Blasen vorhanden sind.
Platzieren Sie einen Abdeckschirm auf der Buchse, so dass Sie Platz zum Einführen Ihrer Pipettenspitze haben. Nehmen Sie Proben von 50.000 Zellen und injizieren Sie sie, indem Sie Ihre Spitze zwischen dem Deckglas und der Buchse platzieren. Inkubieren Sie die Platte in einem Zellkultur-Inkubator mit 5 % Kohlendioxid für eine Woche oder weniger.
Je nach Versuchsdesign sind mindestens drei Tage notwendig, damit die Zellen auf dem Deckglas in einer anderen Platte haften. Rückseiten-Deckgläser in zwei ml Medium. In fortlaufender Kultur können dann Deckgläser in Formalin für Immunfluoreszenzexperimente oder für D-N-A-R-N-A- und Proteinextraktionen fixiert werden.
Die Dedifferenzierung reifer Adipozyten führt zu großen Veränderungen in der Zellmorphologie. Während dieses Prozesses verlieren Adipozyten ihren Phänotyp und verringern die Expression von Transkripten, die normalerweise mit ihrer Lipidspeicherfunktion verbunden sind. Dieses Immunfluoreszenzbild zeigt Fettzellen in verschiedenen Stadien der Dedifferenzierung.
Die Zellen mit der runden Morphologie exprimieren immer noch FABP four, einen reifen Adipozytenmarker, während die länglichen Zellen ihn nicht mehr exprimieren. D-differenzierte Fettzellen, oft auch D-Fettzellen genannt, können von jungen, alten, mageren oder OB-basischen Patienten gewonnen werden. Ihre langfristige Kulturkapazität und ihre nachgewiesene Multipotenz
.Ich mag auch ihr Potenzial für das Tissue Engineering und die Zelltherapie. Sie könnten ein neues Modell für die postspezifische Untersuchung der Adipozytenphysiologie darstellen.
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Übersicht
Diese Studie untersucht die Dedifferenzierung reifer Adipozyten in multipotente Stammzellen. Mithilfe von Kollagenase-Digestion und der Abdeckplatten-Kulturtechnik können Forscher diese Zellen isolieren und kultivieren, um eine homogene Population fibroblastenähnlicher Zellen zu erhalten.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Stammzellforschung
- Adipozytenbiologie
- Zellkultivierungstechniken
Hintergrund
- Reife Adipozyten können sich in Vorläuferzellen zurückentwickeln.
- Dieser Prozess kann in vitro mithilfe spezifischer Kultivierungsmethoden durchgeführt werden.
- Die Isolierung von Adipozyten ist entscheidend für die Gewinnung von Stammzellen.
- Die Kollagenaseverdauung ist eine Standardmethode zur Zellisolierung.
Zweck der Studie
- Gewinnung von multipotenten, dedifferenzierten Fettzellen aus menschlichen reifen Adipozyten.
- Entwicklung eines Protokolls zur Isolierung und Kultivierung dieser Zellen.
- Untersuchung der morphologischen Veränderungen während der Dedifferenzierung.
Verwendete Methoden
- Kollagenase-Digestion zur Isolierung reifer Adipozyten.
- Abdichtungs-Kultivierungstechnik zur Förderung der Dedifferenzierung.
- Beurteilung der Zellmorphologie zur Bestätigung der Dedifferenzierung.
- Quantifizierung der Zellausbeute basierend auf dem Gewebegewicht.
Hauptergebnisse
- Erfolgreiche Isolierung von etwa einer Million Zellen pro Gramm Fettgewebe.
- Die dedifferenzierten Zellen zeigten eine langgestreckte, fibroblastenähnliche Morphologie.
- Homogene Zellpopulationen wurden durch die beschriebenen Methoden gewonnen.
- Nachweis des Potenzials reifer Adipozyten als Quelle von Stammzellen.
Schlussfolgerungen
- Reife Adipozyten können effektiv in multipotente Stammzellen umgewandelt werden.
- Die beschriebenen Methoden bieten einen zuverlässigen Ansatz für die Stammzellforschung.
- Diese Studie trägt zum Verständnis der Adipozyten-Plastizität bei.
Häufig gestellte Fragen
Ausschlaggebende Bedeutung für die Industrie
Die Dedifferenzierung reifer Adipozyten in multipotente Stammzellen bietet eine neuartige Quelle für Anwendungen in der regenerativen Medizin und Gewebeengineering. Dieser Ansatz ermöglicht die depotspezifische Charakterisierung der Funktion und metabolischen Eigenschaften von Adipozyten und unterstützt die Validierung von Zielstrukturen in der Forschung zu Stoffwechselerkrankungen. Die Methode stellt eine skalierbare Plattform zur Erzeugung fibroblastenähnlicher Zellen mit nachgewiesener Multipotenz bereit und erleichtert die Entwicklung präklinischer Modelle sowie die mechanistische Risikominimierung bei der entdeckungsorientierten Erforschung adipozytenbasierter Therapien.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Wissenschaftlicher Wert: Ermöglicht die Untersuchung der Adipozytenplastizität und die Überprüfung therapeutischer Hypothesen in Stoffwechselkrankheitswegen.
- Operativer Wert: Bietet ein reproduzierbares System zur funktionellen Zielvalidierung durch depotspezifische Adipozytenisolierung.
- Wissenschaftlicher Wert: Unterstützt die Vorhersagegenauigkeit, indem homogene Populationen dedifferenzierter Zellen zur Aufklärung von Signalwegen erzeugt werden.
Screening und Assay-Entwicklung
- Wissenschaftlicher Wert: Bereitet validierte biologische Systeme für nachgeschaltete Arbeitsabläufe durch standardisierte Kollagenase-Digestion und Deckenkultur-Techniken vor.
- Operativer Wert: Gewährleistet Standardisierung und Reproduzierbarkeit von Assays durch kontrollierte Adipozytenausbeute (etwa 1 Million Zellen pro Gramm Gewebe).
- Wissenschaftlicher Wert: Ermöglicht zuverlässige Wirkstoffevaluierung unter Verwendung fibroblastenähnlicher Zellen mit nachgewiesener Herabregulation von FABP4 als Differenzierungsmarker.
Translationale und präklinische Forschung
- Wissenschaftlicher Wert: Unterstützt die Entwicklung krankheitsrelevanter Systeme zur standortspezifischen Untersuchung der Adipozytenphysiologie.
- Operationaler Wert: Gewährleistet eine translationale Kontinuität von der Entdeckung bis zur präklinischen Validierung durch die Langzeitkulturkapazität dedifferenzierter Fettzellen.
- Wissenschaftlicher Wert: Erleichtert risikoadjustierte Entscheidungen über die Weiterentwicklung, indem die Multipotenz und das Gewebeengineering-Potenzial von D-Fettzellen aufgezeigt werden.
Pipeline- und Workflow-Integration
Die Methode integriert sich in den Entdeckungsprozess von der frühen Target-Validierung über die Lead-Identifizierung bis hin zu präklinischen Studien, insbesondere für Programme im Bereich Stoffwechselerkrankungen und regenerative Medizin.
- Entdeckungsbiochemie Unterstützt die Hypothesenprüfung und biologische Risikominderung durch Modellierung der Adipozyten-Dedifferenzierung in vitro.
- Screening: Ermöglicht die Bereitschaft für Assays und quantitative Ausgaben durch standardisierte Zellisolierung und Beurteilung der Morphologie.
- Analytik: Bietet messbare Messgrößen wie Veränderungen der FABP4-Expression, um Dedifferenzierungszustände unter verschiedenen Bedingungen zu vergleichen.
- Translationale Forschung Schließt an die präklinische Kontinuität an durch nachgewiesene Langzeitkultur und Multipotenz dedifferenzierter Adipozyten.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Ermöglicht eine wiederverwendbare Methode zur Gewinnung von adipocytenabgeleiteten Stammzellen in mehreren depotspezifischen Untersuchungen.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Vorhersagegenauigkeit durch Verringerung mechanistischer Uneindeutigkeiten beim Phänotypwechsel von Adipozyten.
- Operativer Wert: Standardisierung und Skalierbarkeit durch definierte Kollagenaseverdauung und invertierte Kultivierungsprotokolle.
- Strategischer Wert: Verbesserte Go/No-Go-Entscheidungen durch die Möglichkeit, depotspezifische metabolische Eigenschaften vor der Lead-Optimierung zu charakterisieren.
- Portfolio-Wirkung: Risikoadjustierte Priorisierung durch validierte Beurteilung von Stammzellausbeute und Differenzierungspotenzial.
Durchführungsaspekte
- Erfordert Fachkenntnisse in der Isolation primärer Adipozyten und in Kollagenase-Digestions-Techniken.
- Setzt eine Zellkultur-Infrastruktur voraus, die in der Lage ist, Deckelkulturen in umgekehrten Flaschen oder 6-Well-Platten zu betreiben.
- Erfordert eine standardisierte Vorgehensweise über mehrere Arbeitsgruppen hinweg, um eine konsistente Ausbeute an Adipozyten und eine vergleichbare Beurteilung der Dedifferenzierung zwischen verschiedenen Laboren zu gewährleisten.
- Beinhaltet Anpassungsüberlegungen, wenn das Protokoll auf Fettgewebe aus verschiedenen Depotregionen oder mit unterschiedlichen Spendermerkmalen angewendet wird.
- Umfasst praktische Einschränkungen, wie beispielsweise die Notwendigkeit einer exakten Befüllung des Kulturmediums, um Blasenbildung und damit verbundene Störungen während der umgekehrten Kultur zu vermeiden.
