Studieren der Stöchiometrie der Epidermal Growth Factor Receptor in intakten Zellen mit korrelative Mikroskopie

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments ist es, die Verteilung und Stöchiometrie von epidermalen Wachstumsfaktorrezeptoren oder EGFRs in der Plasmamembran intakter und hydratisierter Zellen mit Hilfe von Fluoreszenz- und Elektronenmikroskopie sichtbar zu machen. Dies wird erreicht, indem zunächst EGFR-exprimierende Zellen wie cos seven auf Mikrochips mit einer 50 Nanometer dünnen Siliziumnitrid-Membran gezüchtet werden, die sich über einen zentral gelegenen Fensterbereich erstreckt. Als nächstes werden die Zellen mit einer biotinylierten Version des epidermalen Wachstumsfaktors inkubiert, die an den Rezeptor bindet und die Bestätigung von EGFR verändert, was zu einer Dimerisierung und Aktivierung führt.

Als nächstes werden die Zellen fixiert, um die Rezeptoren zu immobilisieren und mit gestrippten Hagen-konjugierten Quantenpunkten inkubiert, die an die EGF-aktivierten Rezeptoren binden, und die Zellen werden abgebildet. Schließlich vernetzt eine zweite Fixierung mit Glutaraldehyd die gestrippte Gewohnheit in konjugierten Quantenpunkten mit dem EGFR und stabilisiert die Probe für die Elektronenmikroskopie. Die Ergebnisse zeigen eine Mission der roten Fluoreszenz durch fluoreszierende Quantenpunktbildgebung und EGFR-Verteilung und stöchiometrischen Zustand oder Clustering mittels Rastertransmissionselektronenmikroskopie.

Diese Methode liefert einzigartige Informationen über die Stammgeometrie und -verteilung von Membranrezeptoren in intakten Zellen und kann verwendet werden, um Einblicke in die Aktivierung des epidermalen Wachstumsfaktor-Rezeptors in normalen und in Krebszellen zu erhalten. Es kann auch angewendet werden, um andere Membranrezeptoren wie Ionenkanäle zu untersuchen, während Sie unter einer chemischen Haube arbeiten. Für die ersten Vorbereitungsschritte von Siliziumnitrid-Membran-Mikrochips und nach dem Eintauchen eines Acetons gemäß dem Textprotokoll werden die Mikrochips direkt in ein Becherglas mit Ethanol übertragen und zwei Minuten gewartet, die Chips aus dem Ethanol entfernt und auf ein Reinraumgewebe gelegt.

Wenn die Chips getrocknet sind, geben Sie sie auf einen Glasobjektträger, der zuvor in eine Petrischale gelegt wurde. Lege dann den Deckel auf die Schüssel. Legen Sie anschließend den Objektträger mit den Mikrochips in einen Plasmareiniger.

Führen Sie ein fünfminütiges Standardreinigungsprogramm durch, um die Oberfläche der Siliziumnitridmembran hydrophil zu machen. Übertragen Sie dann unter der Laminar-Flow-Haube die Mikrochips aus dem Glas. Schieben Sie es auf ein Reinraumgewebe, bevor Sie es in eine Vertiefung einer 24-Well-Platte legen, die mit Poly-L-Lysinlösung oder PLL gefüllt ist und fünf Minuten lang inkubiert.

Übertragen Sie dann die Mikrochips nacheinander in eine zweite Vertiefung mit Wasser in HPLC-Qualität, bevor Sie sie in einer zweiten Vertiefung mit Wasser spülen. Platzieren Sie schließlich die Mikrochips einzeln in mit DM gefüllte Vertiefungen einer 96-Well-Platte und platzieren Sie die Platte in einem Kohlendioxid-Inkubator unter Verwendung einer COS-Subkultur mit sieben Zellen. Bereiten Sie eine monodispergierte Zellsuspension mit einer Konzentration von etwa fünfmal 10 vor.

Die fünften Zellen pro Milliliter. Geben Sie ein Tröpfchen Zellsuspension auf jeden Mikrochip in der Wandplatte 96 und inkubieren Sie mit einem inversen Mikroskop fünf Minuten lang Raumtemperatur. Beginnen Sie, die Bereiche der Mikrochips zu untersuchen, um eine ungefähre Dichte von 20 bis 30 bis sieben Zellen pro 150 x 400 Mikrometer Fenster zu erreichen.

Wenn die Zellen ausreichend adhäsiert haben, werden die Mikrochips vorsichtig mit dem Zellabstand in neue Vertiefungen mit dm überführt. Wenn noch genügend Zellen haften, werden die Mikrochips mit den Zellen nach oben in neue Vertiefungen mit serumfreiem DMM überführt. Anschließend inkubieren Sie die Mikrochips bei 37 Grad Celsius in einem Kohlendioxid-Inkubator mehrere Stunden bis über Nacht für die folgenden Schritte.

Mit 96 wird die Well-Platte mit den erforderlichen Lösungen aufgefüllt und eine Rudersäule pro Mikrochip verwendet. Spülen Sie die Mikrochips ab, indem Sie sie in eine Vertiefung mit frischem B-S-A-G-E-L-P-B-S geben und fünf Minuten lang bei 37 Grad Celsius inkubieren. Übertragen Sie die Mikrochips in eine 300 Nanomolare EGF-Biotinlösung und legen Sie sie für drei Minuten zurück in den Inkubator, da die Zellen beginnen, den EGF-markierten EGFR zu endozieren.

Verwenden Sie PBS, um die Mikrochips dreimal zu spülen. Verwenden Sie dann 0,1 molaren Katepuffer oder CB, um die Proben zu spülen. Übertragen Sie die Mikrochips anschließend in 3%PFA und inkubieren Sie sie 10 Minuten lang.

Nach einmaligem Spülen mit CB und dreimaligem Spülen mit PBS werden die Chips in G-L-Y-P-B-S überführt und zwei Minuten lang inkubiert. Verwenden Sie dann PBS, um zweimal zu spülen. Legen Sie nun die Mikrochips 10 Minuten lang in 10 NANOMOLARE S-T-R-Q-D, bevor Sie viermal mit B-S-A-P-B-S spülen.

Tauchen Sie dann einen Mikrochip in eine 35-Millimeter-Glasschale, die mit B-S-A-P-B-S bei Raumtemperatur vorgefüllt ist, um die Zellen mit DIC und Fluoreszenzmikroskopie abzubilden. Verwenden Sie ein 40-fach-Luftobjektiv für Übersichtsbilder von Zellen, die mit QD 6 55 beschriftet sind. Verwenden Sie einen Filterwürfel, der die Quantenpunkte zwischen 340 und 380 Nanometern mit einer Emission über 420 Nanometern anregt.

Minimieren Sie die Lichtintensität, um zwei intensive Lichteinwirkungen zu vermeiden, die die Probe beschädigen könnten. Stellen Sie die Belichtungszeit auf mindestens 300 Millisekunden ein, damit die Signale aller QDs als QD-Fluoreszenzblinken erfasst werden, passen Sie die Lichtintensität und die Verstärkung an, um helle Bilder ohne sichtbares Bildrauschen zu liefern und gleichzeitig die Lichtintensität zu minimieren. Setzen Sie den Mikrochip nach der Bildgebung wieder in eine 96er Wandplatte mit B-S-A-P-B-S ein.

Einmal in Cb spülen, dann ein 2%iges Glutaraldehyd übertragen und 10 Minuten nach dem weiteren inkubieren. Waschen und CB verwenden B-S-A-P-B-S, um den Mikrochip dreimal zu waschen, lagern Sie in B-S-A-P-B-S vorgefüllte Vertiefungen einer neuen 96-Well-Platte für jeden Mikrochip. Füllen Sie eine Reihe von vier Vertiefungen mit Wasser in HPLC-Qualität.

Nachdem Sie das ESEM gemäß dem Textprotokoll eingerichtet haben, laden Sie eine Probe in den pre-COOL ESEM STEM-Tisch, indem Sie die 96 WAT-Platte aus dem Kühlbehälter nehmen und in die Nähe des geöffneten ESEM-Tisches legen. Legen Sie ein Reinraumtuch daneben. Spülen Sie einen Mikrochip schnell aus, indem Sie ihn viermal für jeweils eine Sekunde in eine mit HPLC-Wasser gefüllte Vertiefung tauchen.

Tupfen Sie die Rückseite des Mikrochips kurz auf das Gewebe und legen Sie ihn mit drei Mikrolitern gekühltem Wasser in HPLC-Qualität in die vorgekühlte Stufe. Befeuchten Sie die Oberfläche der Probe und fixieren Sie die Probe auf dem Tisch. Legen Sie dann drei weitere drei Mikroliter Wassertröpfchen auf den Tisch in der Nähe der Probe und verschließen Sie die Probenkammer.

Nachdem Sie eine Zelle von Interesse identifiziert haben, zeichnen Sie gemäß dem Textprotokoll ein STEM-Übersichtsbild der Zelle auf, begeben Sie sich zu einem peripheren Bereich einer Zelle, in dem der Zellrand sichtbar ist, und zoomen Sie auf 50.000-fache Vergrößerung. Nehmen Sie Bilder auf, die einzelne qds zeigen, und verwenden Sie Pixelverweilzeiten von 20 bis 30 Mikrosekunden. Die hier gezeigten QD 6 55 markierten membrangebundenen EGFR in intakten, vollständig hydratisierten COS-sieben Zellen zeigen. Das DIC-Bild zeigt hier die Membrantopographie der Zellen und das entsprechende Fluoreszenzbild zeigt die Verteilung von EGFR über die gesamte Oberfläche der Zelle nach dreiminütiger EGF-Biotin-Inkubation.

Diese ESEM-STEM-Bilder mit geringer Vergrößerung zeigen feine Strukturen wie Filopodien, die sich von der Zelle zu benachbarten Zellen erstrecken, und einige Strukturen in den dünneren Zellregionen. Dicke zentrale zelluläre Regionen, einschließlich des Zellkerns, erscheinen weiß, da eine Übertragung durch die Probe für Elektronen der verwendeten Energie nicht möglich ist. Hohe Auflösung.

ESEM-STEM-Bilder der dünneren peripheren Bereiche zeigen QD-Markierungen auf einer Membranfalte, die das Bild diagonal kreuzt. Diese Membranstruktur weist an mehreren Stellen eine höhere EGFR-Dichte auf als die umgebenden Membranregionen, zwei Markierungen befanden sich in unmittelbarer Nähe. Zwei Beispiele mit Abständen von 20 und 24 Nanometern sind mit Pfeilspitzen gekennzeichnet.

Diese Bezeichnungspaare werden als zu EGF Fers gehörend interpretiert. Dieses Bild wurde von einer Region mit geringerer EGFR-Dichte und geringerem Fluoreszenzsignal aufgenommen. Nichtsdestotrotz wurde EGFR auch hier in Dimeren gefunden und es waren zwei Cluster von 10 oder 11 EEG vorhanden.

Einmal gemeistert, kann die Probenvorbereitung innerhalb von zwei Stunden durchgeführt werden, viel schneller als bei den üblichen Techniken der Elektronenmikroskopie. Die anschließende essem STEM-Bildgebung kann innerhalb eines halben Tages bis zu 100 hochauflösende Bilder liefern.