Quantifizierung von filamentösen Aktin (F-Aktin) Puncta in Rat Cortical Neurons

Das übergeordnete Ziel dieser Quantifizierung von filamentösem Aktin-Punkten in kultivierten Neuronen besteht darin, eine nützliche Methode zur Untersuchung der Integrität und Kognitivität synaptischer Strukturen einzuführen. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich der Neurowissenschaften bezüglich der Spinogenese, synaptischen Plastizität und synaptischen Stabilität zu beantworten. Der Hauptvorteil dieser Technik liegt darin, dass sie ein detailliertes Protokoll für die primäre Neuronenkultur sowie die Identifizierung und Quantifizierung von F-Aktin-Punkten bereitstellt.

Wenn das Ziel der Untersuchung unbekannt ist, ist es notwendig, die allgemeine Integrität der retinalen Fundamentstrukturen abzuschätzen. Wir hatten die Idee zu dieser Methode erstmals, als wir die durch Suchtstoffe wie Kokain sowie durch toxische HIV-Proteine wie tat und JP 120 verursachten Neuronenschäden untersuchten. Zwei Tage vor dem Aufbau der Kultur beschichten Sie 12, 35-Millimeter-Glasbodenkulturschalen mit zwei Millilitern Poly-L-Lysin-Arbeitslösung und lagern die Schalen über Nacht im Sicherheitswerkbank, um deren Sterilität aufrechtzuerhalten.

Am nächsten Tag das Beschichtungsmedium verwerfen und die Schalen mit doppelt destilliertem Wasser spülen. Die Schalen eine Stunde lang unter dem Abzug trocknen lassen. Anschließend zwei Milliliter Plattenmedium in jede Schale geben.

Und inkubieren Sie die Petrischalen über Nacht bei 37 Grad Celsius und fünf Prozent Kohlendioxid. Am Tag der Kultur geben Sie das geerntete Gehirn in eine Petrischale mit kaltem HBSS. Befestigen Sie dann das Gehirn mit einer Pinzette und verwenden Sie die gebogene Pinzette, um die Hemisphären zu trennen und die Hirnhäute zu entfernen.

Isolieren Sie die frontalen Kortizes und überführen Sie die Gewebestücke in ein steriles 15-Milliliter-Zentrifugenröhrchen. Geben Sie zwei Milliliter frisches HBSS und 20 Mikroliter Trypsin-EDTA in das Röhrchen und inkubieren Sie das neuronale Gewebe 10 bis 15 Minuten bei Raumtemperatur, wobei alle paar Minuten vorsichtig geschwenkt wird.

Am Ende der Inkubation alle alte HBSS mit einer Glaspipette absaugen. Die Kortizes zweimal mit frischer HBSS spülen. Nach der zweiten Wäsche das Gewebe in Trypsininhibitor eintauchen.

Gut mischen und die Probe fünf Minuten bei Raumtemperatur ruhen lassen. Anschließend die Gewebe zwei Mal mit frischem HBSS waschen. Nun die Gehirnstücke mit einer Glaspipette und Gummiball langsam 10 bis 15 Mal auf- und abpipettieren.

Danach das Gewebepulver mit einer kalibrierten Pipette, die mit einer sterilen Spitze mit reduziertem Durchmesser ausgestattet ist, erneut sehr langsam auf- und abpipettieren. Sobald die Lösung homogen ist, die Zellen in der geeigneten Dichte auf die vorbeschichteten Kulturschalen ausplattieren und über Nacht im Zellkultur-Inkubator inkubieren. Nach 24 Stunden das Ausplattiermedium durch frisch zubereitetes, vollständiges, serumfreies, eng begrenztes Basalmedium ersetzen.

Und inkubieren Sie die Zellen für mindestens 12 bis 14 Tage im Zellkulturinkubator. Die Plattenung mit geringer Dichte ist wichtig, um einzelne Neuronen sichtbar zu machen. Und das neuronale Basalmedium ist entscheidend, um die Perforation von Astrozellen in den Zellkulturen zu minimieren.

Um die Zellen für die Immunzytochemie zu markieren, spülen Sie die Zellkulturschale mit Glasboden zunächst zwei Mal mit PBS. Danach fixieren Sie die Zellen 15 Minuten bei Raumtemperatur mit vierprozentigem Paraformaldehyd, gefolgt von zwei weiteren PBS-Spülgängen.

Anschließend permeabilisieren Sie die Zellen mit 0,1 Prozent Triton X-100 in PBS für fünf Minuten und färben sie bei Raumtemperatur mit einem F-Aktin-spezifischen Farbstoff. Nach 20 Minuten spülen Sie die Zellen zwei Mal mit PBS ab und blockieren jegliche unspezifische Zelloberflächenfärbung mit 10 % normalem Ziegenserum. Am Ende der Inkubation färben Sie die Zellen über Nacht bei vier Grad Celsius mit einem polyklonalen Hühner-Antikörper gegen MAP2.

Am nächsten Morgen die Zellen zwei Mal mit PBS spülen und mit dem entsprechenden sekundären Antikörper markieren. Nach zwei Stunden bei Raumtemperatur die Zellen erneut mit PBS spülen und für drei Minuten bei Raumtemperatur mit 10 Mikrolitern huxs markieren. Anschließend die Zellen abschließend zwei Mal mit PBS waschen und mit 100 Mikrolitern Anti-Fade-Reagenz konservieren.

Innerhalb von drei Tagen nach dieser Färbung das Fluoreszenzmikroskop einschalten und das 20×-Objektiv auswählen. Anschließend im Mikroskop-Software die Pixel-Bildgröße auf 1600 × 1200 und die Bildauflösung von 0,17 Mikrometern pro Pixel auf 1×-Zoom einstellen. Die Zellkultur-Schale auf den Mikroskoptisch übertragen.

Und gewinnen Sie Bilder der co-markierten F-Aktin-Map-2-Neurone in den grünen und roten fluoreszierenden Kanälen. Sobald alle Bilder erhalten wurden, wählen Sie fünf Bilder einzelner Neurone in den grünen, roten und blauen Kanälen mit klar definierten dendritischen Bäumen aus und verwenden Sie die kontinuierliche Map-2-Immunfluoreszenz, um die F-Aktin-reichen Strukturen in den dendritischen Segmenten zweiter Ordnung zu identifizieren.

Drehen Sie den ausgewählten Bildbereich horizontal und kopieren Sie diesen Bereich als neues Bild. Anschließend subtrahieren Sie die Hintergrundfluoreszenz des Bildes und zählen mithilfe der Software die Anzahl der hellgrünen F-Aktin-Punkte.

Verwenden Sie geschulte unabhängige Beobachter, um die Länge der ausgewählten dendritischen Segmente zu messen. Anschließend exportieren Sie die Anzahl der Pünktchen sowie die Daten zur Länge der dendritischen Segmente in eine Tabellenkalkulationsdatei. Stellen Sie sicher, dass die Beobachter F-Aktin-Postur-Pünktchen mit einer rosa Fluoreszenzintensität von mindestens 50 % über der durchschnittlichen Intensität der Färbung im dendritischen Schaft in jedem ausgewählten Segment einbeziehen.

Berechnen Sie abschließend die Dichte gemäß der Formel und geben Sie die Daten als Anzahl der F-Aktin-Punkte pro zehn Mikrometer Dendrit an. Hier zeigen Differenzinterferenzkontrast-Aufnahmen die morphologischen Veränderungen, die in sich entwickelnden kortikalen Fetalneuronen von Ratten im Kulturzeitraum von Tag 4 bis 27 beobachtet wurden. Beachten Sie die Zunahme von Länge und Anzahl der Dendriten, während sich die kultivierten primären Rattenneuronen weiterentwickeln.

Da die Phalloidin-Färbung von F-Aktin sehr schnell ist, kann die Integrität des synapto-dendritischen Netzwerks visuell beurteilt werden, bevor mit der immunzytochemischen Antikörper-Färbung fortgefahren wird. Map2 färbt intakte Dendriten und bestätigt so, dass die F-Aktin-Punkte auf neuronalen Dendriten liegen und nicht in anderen Zellen wie Astrozyten lokalisiert sind. In hochauflösenden Bildern können F-Aktin-reiche Strukturen, die Phi-Filopodien, Dornfortsätze und F-Aktin-Flecken enthalten, beobachtet werden.

In diesem Experiment zur Beurteilung der von HIV-1-Tat induzierten synapto-dendritischen Schädigung zeigte die Map2-Färbung weniger dendritische Fortsätze und eine verminderte F-Aktin-Ausprägung in kortikalen Rattenneuronen nach Behandlung mit HIV-1-Tat. Tatsächlich nimmt die Anzahl der F-Aktin-Punkte je nach experimenteller Behandlung zu oder ab. Beispielsweise stieg in diesem Experiment die Dichte der F-Aktin-positiven Punkte signifikant an, als die kultivierten Neuronen mit dem unkopetitiven NMDA-Rezeptorantagonisten Memantin behandelt wurden.

Im Gegensatz dazu führte die Behandlung mit einer Kombination aus Methamphetamin und HIV1-tat zu einem signifikanten Verlust der F-Aktin-Punkte. Nach der Aufnahme von hochauflösenden Bildern der mit Kohle markierten F-Aktin-Map2-Neuronen sollten zwei geschulte Beobachter Segmente der dendritischen Fortsätze zweiter Ordnung zur Analyse der Punkt-Dichten auswählen. Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Weg für Forscher im Bereich der Neurowissenschaftenforschung.

Nicht nur zur Überwachung akuter Synaptopathien, sondern auch zur Untersuchung der synaptischen Erholung und experimenteller neuraler Wiederherstellungsprozesse. Nach dem Anschauen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man eine zuverlässige Methode zur Messung der synaptischen Integrität des neuronalen dendritischen Netzwerks entwickelt.