Probenvorbereitung für die Massen Cytometry-Analyse
29. April 2017
Dieser Artikel beschreibt die Entnahme und Verarbeitung von Proben für die Massenzytometrie-Analyse.
Das übergeordnete Ziel dieses Probenvorbereitungsprozesses ist es, eine robuste und konsistente Antikörperfärbung verschiedener Proben zu erzeugen, um die Untersuchung heterogener Zellpopulationen zu ermöglichen. Diese Methode kann helfen, Fragen zur Zellidentität, zur Zellsignalisierung und zur Zellantwort in einer komplexen heterogenen Zellpopulation zu beantworten. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie die Messung von Proteinspiegeln mit hohen Parametern auf Einzelzellebene ermöglicht.
Dieses Verfahren wird von Aundrietta Duncan, einer Doktorandin aus unserem Labor, demonstriert. Für jede einzelne Zellsuspensionsprobe wird sie bei viermal 10 bis sechs Zellen pro Milliliter in serumfreiem Medium resuspendiert, 500 Mikroliter frisch zubereitetes 50 Mikromolares Cisplatin pro 2/10 in die sechs Zellen gegeben und die Proben auf einem Orbitalschüttler unter ständigem Mischen bei Raumtemperatur inkubiert. Nach einer Minute wird das Cisplatin mit einem gleichen Volumen Waschpuffer abgeschreckt und die Zellen zentrifugiert.
Entsorgen Sie den Überstand und waschen Sie die Proben zwei weitere Male, indem Sie 500 Mikroliter Waschpuffer hinzufügen, die Zellen zentrifugieren und den Waschpuffer abgießen. Anschließend werden die Proben zweimal in 500 Mikrolitern PBS gewaschen, wobei die Proben auf ähnliche Weise zentrifugiert und der Überstand verworfen wird. Nach der zweiten PBS-Wäsche resuspendieren Sie die Pellets in 500 Mikrolitern frischem PBS und fixieren Sie die Zellen mit 500 Mikrolitern 4%PFA.
Pipettieren Sie die Zellen, um sie zu mischen. Anschließend werden die Proben 15 Minuten lang bei Raumtemperatur unter konstantem Mischen auf den Orbitalschüttler gelegt. Am Ende der Inkubation pelletieren Sie die Zellen durch Zentrifugation, gießen den Überstand ab und waschen anschließend frisches PBS.
Um die Zellen zu permeabilisieren, schleudern Sie die Zellen wieder herunter und verwerfen Sie die Überstände. Die Proben werden durch sanftes Vortexen wieder in das restliche PBS suspendiert und sofort ein Milliliter 100 %Methanol pro 2/10 10 in die sechsten Zellen durch sanftes Pipettieren gegeben. Inkubieren Sie die Proben mindestens eine Stunde lang bei vier Grad und zentrifugieren Sie die Zellen am Ende der Inkubation.
Anschließend das Methanol abgießen. Waschen Sie dann die Pellets in einem Milliliter Waschpuffer für jeden Milliliter Methanol, gefolgt von zwei weiteren Waschgängen in 500 Mikrolitern frischem Waschpuffer. Übertragen Sie mit einer 200-Mikroliter-Pipette auf 50 Mikroliter den restlichen Waschpuffer aus jedem Pellet in ein Röhrchen mit dem entsprechenden Antikörpercocktail.
Pipettieren Sie die kombinierte Lösung wieder hoch, ohne Luft in die Spitze zu ziehen, indem Sie den Kolben teilweise gedrückt halten. Übertragen Sie dann die Pipettenspitze in ein 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen mit 500 Mikrolitern Waschpuffer, ohne den Kolben loszulassen. Lassen Sie den Kolben los, ziehen Sie den Waschpuffer für ein Gesamtvolumen des Antikörpercocktails von 50 Mikrolitern auf und markieren Sie die entsprechende Probe durch vorsichtiges Pipettieren mit dem aspirierten Antikörpercocktail.
Waschen Sie die Proben nach einer Stunde bei Raumtemperatur unter ständigem Schütteln viermal und gießen Sie den Waschpuffer jedes Mal ab. Um die Zellen mit Iridium zu markieren, suspendieren Sie die endgültigen Pellets erneut in 500 Mikrolitern PBS, gefolgt von der Zugabe von 500 Mikrolitern vier Prozent PFA für 15 Minuten bei Raumtemperatur. Als nächstes fügen Sie den Proben 500 Mikroliter frisch zubereitetes 62,5 nanomolares Iridium und PFA hinzu, um weitere 15 Minuten bei Raumtemperatur zu schütteln.
Zentrifugieren Sie dann die Zellen, gießen Sie den Überstand ab und folgen Sie zwei Wäschen in 500 Mikrolitern 0,1 Prozent BSA und gefiltertem deionisiertem Wasser. Analysieren Sie die Proben, indem Sie Normalisierungskügelchen in die Vertiefungen der Probenplatten geben, Zellen in diese Vertiefungen pipettieren und dann innerhalb von 24 Stunden eine Massenzytometrie durchführen. Nach Normalisierung der Signalintensität können die Kalibrierperlen aus den Daten entfernt werden, indem die negative Population der Iridium-191-positiven Kügelchen angesteuert wird.
Die Einzelzellereignisse können dann mit einem Gated versehen werden, um die Trümmer und Zellmultipletts unter Verwendung eines biaxialen Diagramms der negativen Expression von Iridium 193 im Vergleich zur Ereignislänge zu entfernen. Die Cisplatin-Markierung kann verwendet werden, um die Zelltiefe zu messen. Hier werden zum Beispiel Proben mit geringen und höheren Mengen an toten Zellen gezeigt.
Die toten Zellen können entfernt werden, indem die Platin-198-positive Population weggeged wird, das Barcoding führt zu einer deutlichen Trennung der Proben innerhalb der Barcoding-Parameter, so dass die Zellen ihren ursprünglichen Probenidentitäten zugeordnet werden können. Die IDU-Markierung kann verwendet werden, um hier beobachtete US-Gesichtszellen zu erkennen. Nach der anfänglichen Normalisierung, dem De-Barcoding und dem Gating können die hochdimensionalen Daten mit dem SPADE-Algorithmus analysiert werden, um eine niedrigdimensionale Darstellung der Daten zu generieren, die sich besser für eine visuelle Interpretation eignet.
Einmal gemeistert, kann diese Technik innerhalb von vier bis sechs Stunden abgeschlossen werden, wenn sie richtig ausgeführt wird. Beim Versuch dieses Verfahrens ist es wichtig, daran zu denken, den Probenverlust während des Waschschritts zu minimieren. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man Proben für die Massenzytometrie-Analyse vorbereitet.
Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit Natriumazid gefährlich sein kann, daher sollten Sie bei der Durchführung dieses Verfahrens Vorsichtsmaßnahmen wie das Tragen geeigneter PSA treffen.
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Übersicht
In diesem Artikel werden die Sammlung und Verarbeitung von Proben für die Massenzytometrie-Analyse beschrieben. Die Methode zielt darauf ab, eine konsistente Antikörpermarkierung zu erzielen, um heterogene Zellpopulationen zu untersuchen.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Neurowissenschaften
- Zellbiologie
- Massenzytometrie
Hintergrund
- Mit der Massenzytometrie können proteinausprägungen mit hohen Parametern auf Einzelzellniveau gemessen werden.
- Sie ist nützlich, um die Zellidentität und Signalübertragung zu verstehen.
- Die Methode ist auf komplexe, heterogene Zellpopulationen anwendbar.
- Die Probenvorbereitung ist entscheidend für robuste Ergebnisse.
Zweck der Studie
- Veranschaulichung eines Probenvorbereitungsverfahrens für die Massenzytometrie.
- Ermöglichung der Untersuchung vielfältiger Zellpopulationen.
- Gewinnung von Erkenntnissen über Zellantworten und -wechselwirkungen.
Verwendete Methoden
- Re-Suspension von Einzelzell-Suspensionsproben in serumfreiem Medium.
- Verwendung frisch zubereiteten Cisplatins für die Zellbehandlung.
- Inkubation auf einem Rütteltablett für eine gleichmäßige Durchmischung.
- Zentrifugation und Waschen der Zellen nach der Behandlung.
Hauptergebnisse
- Demonstration einer effektiven Probenvorbereitungstechnik.
- Konsistente Antikörperanfärbung über alle Proben hinweg erzielt.
- Hochparametrische Analyse auf Einzelzellniveau ermöglicht.
- Erkenntnisse zu heterogenen Zellpopulationen gewonnen.
Schlussfolgerungen
- Die Methode verbessert die Fähigkeit, komplexe Zellpopulationen zu analysieren.
- Eine robuste Probenvorbereitung ist entscheidend für genaue Ergebnisse der Massenzytometrie.
- Diese Technik kann die Forschung in der Zellbiologie und Neurowissenschaft voranbringen.
Häufig gestellte Fragen
Ausführliche Bedeutung für die Industrie
Die Massenzytometrie ermöglicht die hochparametrische Einzelzell-Proteinanalyse und unterstützt so die detaillierte Untersuchung heterogener Zellpopulationen in der Wirkstoffforschung. Eine zuverlässige Probenvorbereitung ist entscheidend, um konsistente und reproduzierbare Daten zu erzeugen, die für die Zielvalidierung und die mechanistische Risikominderung herangezogen werden. Dieses Protokoll hilft Forschungs- und Entwicklungsteams in der Biopharma-Branche, die Variabilität zu verringern und das Vorhersagevertrauen in frühen Entdeckungsworkflows zu verbessern.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Wissenschaftlicher Wert: Ermöglicht die multiplexierte Protein-Profilierung zur Klärung der zellulären Identität und Signalzustände in komplexen Geweben.
- Operativer Wert: Unterstützt die hypothesengeleitete Untersuchung der Zielmolekülbindung von Wirkstoffen und der Modulation von Signalwegen mit Einzelzellauflösung.
Screening und Assay-Entwicklung
- Wissenschaftlicher Wert: Erzeugt standardisierte, hochdimensionale Messgrößen zur Beurteilung der Wirkung von Verbindungen in verschiedenen Zelltypen.
- Operationaler Wert: Etabliert reproduzierbare Färbungs- und Fixierungsverfahren, die für die Skalierbarkeit des Assays und den Vergleich zwischen Experimenten entscheidend sind.
Translationale und präklinische Forschung
- Wissenschaftlicher Wert: Ermöglicht die Entdeckung von Biomarkern und die phänotypische Charakterisierung in krankheitsrelevanten Modellen.
- Operationaler Wert: Ermöglicht die longitudinale Verfolgung zellulärer Reaktionen, um Go/No-Go-Entscheidungen bei der präklinischen Weiterentwicklung zu unterstützen.
Pipeline- und Workflow-Integration
Die Methode fügt sich nahtlos in den Entdeckungsprozess von der Target-Validierung bis hin zur Lead-Optimierung ein und liefert quantitative Daten mit Einzelzellauflösung, die Bulk-Assays und funktionelle Screens ergänzen.
- Entdeckungsbiochemie: Ermöglicht eine detaillierte Kartierung der zellulären Heterogenität und dynamischer Veränderungen der Proteinausprägung als Reaktion auf Störungen.
- Screening: Liefert multiplexe, quantitative Ergebnisse, die für die Validierung von Hits und die Aufklärung des Wirkmechanismus geeignet sind.
- Analytik: Erzeugt hochdimensionale Daten, die eine rechnergestützte Gating- und Normalisierungsmethode zur genauen Interpretation erfordern.
- Translationale Forschung: Unterstützt die Abstimmung mit präklinischen Modellen, indem sie eine konsistente Immunphänotypisierung über verschiedene Probensätze hinweg ermöglicht.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Schafft eine standardisierte Grundlage für die Probenvorbereitung, die eine wiederverwendbare Massenzytometrie-Plattform über verschiedene Projekte hinweg ermöglicht.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Erhöht die Vorhersagesicherheit durch umfassende Protein-Profilierung mit Einzelzellauflösung.
- Operationaler Wert: Verbessert die Reproduzierbarkeit und minimiert technische Variabilität durch standardisierte Schritte der Wäsche, Fixierung und Permeabilisierung.
- Strategischer Wert: Verbessert die Zielstrukturauswahl und die Optimierung von Wirkstoffkandidaten, indem biologische Unschärfen in komplexen Proben reduziert werden.
- Portfolio-Implikation: Ermöglicht datengestützte Priorisierung, indem Nebenwirkungen und zellzustandsspezifische Reaktionen frühzeitig im Entdeckungsprozess aufgedeckt werden.
Durchführungsüberlegungen
- Erfordert Fachkenntnisse in den Grundlagen der Durchflusszytometrie, der Antikörpanel-Planung und im Umgang mit metallkonjugierten Reagenzien.
- Setzt den Zugang zu einem Massenzytometer, Zentrifugiergeräten und Rüttelapparaten für eine konsistente Probenvorbereitung voraus.
- Erfordert standardisierte Arbeitsanweisungen für die Reagenzherstellung, insbesondere für die Cisplatin- und methanolbasierte Permeabilisierung, um eine Konsistenz zwischen verschiedenen Ansätzen sicherzustellen.
- Beinhaltet Anpassungsüberlegungen, wenn das Protokoll auf unterschiedliche Probenarten wie primäres Gewebe, Blut oder kultivierte Zellen angewendet wird.
- Umfasst praktische Einschränkungen hinsichtlich des Probenverlusts während mehrfacher Waschschritte sowie die Notwendigkeit einer sorgfältigen Titration von Antikörpercocktails, um das Hintergrundsignal zu minimieren.
