Chondrogene Differenzierung Induktion von Fettgewebe gewonnene Stammzellen durch Zentrifugalkraft Gravity
24. Februar 2017
Mechanischer Stress kann die chondrogene Differenzierung von Stammzellen induzieren und bietet damit einen potentiellen therapeutischen Ansatz für die Reparatur von gestörtem Knorpel. Wir stellen ein Protokoll vor, um die chondrogene Differenzierung von aus Fett gewonnenen Stammzellen (ASCs) mit Hilfe der Zentrifugalgravitation (CG) zu induzieren. Die CG-induzierte Hochregulierung von SOX9 führt zur Entwicklung chondrogener Phänotypen.
Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, eine chondrogene Differenzierung von ASCs für eine defekte Knorpelreparatur zu induzieren. Mit dieser Methode soll die prächondrogene Differenzierung von ASCs mit Hilfe der Zentrifugalgravitation induziert werden. Obwohl diese Methode einen Einblick in die chondrogene Differenzierung von ASCs geben kann, kann sie auch auf andere Systeme angewendet werden, wie z.B. die osteogene und fibrogene Differenzierung.
Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass die chondrogene Differenzierung aus Stammzellen leicht induziert werden kann, ohne dass Zytokine behandelt werden müssen. Das Verfahren wird von Yeri Alice Rim und Yoojun Nam aus meinem Labor vorgeführt. Beginnen Sie mit der Entnahme von 80 % konfluenten Stammzellen aus Fett aus einer 100-Milliliter-Kulturschale, indem Sie das Medium verwerfen und mit fünf Millilitern PBS waschen.
Fügen Sie dann einen Milliliter PBS mit einem millimolaren EDTA hinzu und inkubieren Sie zwei Minuten lang bei 37 Grad Celsius in einem befeuchteten Inkubator mit 5 % Kohlendioxid. Klopfen Sie nach zwei Minuten vorsichtig auf die Kulturplatte, fügen Sie vier Milliliter frisches Medium hinzu und geben Sie die Zellen in ein konisches 15-Milliliter-Röhrchen. Die Zellen werden bei 250 mal g für zwei Minuten bei Raumtemperatur zentrifugiert.
Entfernen Sie nach dem Zentrifugieren den Überstand, ohne das Pellet zu stören. Suspendieren Sie dann das Pellet wieder in 10 Millilitern Medium. Zählen Sie die Zellen mit einem Hämozytometer.
Für die Zentrifugalgravitation wird das 2,5-fache Zehnfache in die fünften Zellen in ein neues konisches 15-Milliliter-Röhrchen überführt und 15 Minuten lang bei 2400 g zentrifugiert. Fahren Sie nach der Zentrifugation entweder mit einer Pellet- oder Mikromassenkultur fort. Unmittelbar nach der Zentrifugation wird der Überstand und bei 500 Mikrolitern chondrogenem Differenzierungsmedium (CDM) und 50 Mikrogramm pro Milliliter frisch zubereitetem L-Ascorbinsäure-2-phosphat in das Pellet aspiriert.
Eine Positivkontrolle, induziert die chondrogene Differenzierung und sammelt ihre Zellen durch Zugabe von CDM, das 10 Nanogramm pro Milliliter TGF-beta-1 enthält. Verschließen Sie die Röhrchen locker und inkubieren Sie sie drei Wochen lang bei 37 Grad Celsius in einem befeuchteten Inkubator mit 5 % Kohlendioxid. Unmittelbar nach der Schwerkraftzentrifugation wird der Überstand abgesaugt und das Pellet in 10 Mikrolitern CDM wieder suspendiert.
Um eine Mikromasse zu bilden, pipettieren Sie die resuspendierten Zellen in die Mitte einer Vertiefung einer 24-Well-Platte und legen Sie die Platte dann in den Inkubator. Geben Sie nach zwei Stunden vorsichtig 500 Mikroliter CDM in die Vertiefung und pipetieren Sie gegen die Wand der Platte, um eine Störung der Mikromasse zu vermeiden. Als Positivkontrolle wird eine Mikromassenkultur mit nicht zentrifugierten Zellen durchgeführt, indem CDM mit 10 Nanogramm pro Milliliter TGF-beta-1 hinzugefügt wird.
Inkubieren Sie die Mikromasse drei Wochen lang. Verwenden Sie am 21. Tag nach der Bildung der Mikromasse eine Pipette, um die Sphäroidpellets zu ernten, und waschen Sie sie dann mit 1X PBS. Fixieren Sie die Sphäroidpellets, indem Sie sie 24 Stunden lang in 4%iges Paraformaldehyd eintauchen.
Entsorgen Sie am nächsten Tag das Fixiermittel und spülen Sie die Zellpellets mit entionisiertem Wasser ab. Legen Sie eine Schicht Gaze auf die Gewebekassette und übertragen Sie die fixierten Sphäroid-Pellets mit einer Pipette. Decken Sie das Pellet ab, indem Sie die Gaze falten und den Kassettendeckel schließen.
Als nächstes dehydrieren Sie die Sphäroidpellets, indem Sie sie fünf Minuten lang bei Raumtemperatur in 70%iges Ethanol eintauchen. Fahren Sie dann mit einer Reihe von Ethanolkonzentrationen für jeweils fünf Minuten fort. Tauchen Sie die Pellets dann 15 Minuten lang in 100%iges Xylol.
Tauchen Sie die Sphäroidpellets zum Einbetten in 56 Grad Celsius warmes Paraffin. Schneiden Sie anschließend mit einem Rotationsmikrotom fünf Mikrometer dicke Abschnitte aus dem in Paraffin eingebetteten Zellpellet ab. Schwimmen Sie die Abschnitte in 50%igem Ethanol und geben Sie sie dann in ein 50 Grad Celsius heißes Wasserbad.
Montieren Sie die schwimmenden Abschnitte auf Objektträger und fahren Sie dann mit Safranin O und Alcian Blue für die Immunfluoreszenzfärbung fort. Um eine geeignete Zentrifugalgravitationskraft zu bestimmen, wurden ASCs bei einer Zentrifugalgravitation von null, 300, 600, 1, 200 und 2.400 g für fünfzehn Minuten gedreht. Die SOX9-mRNA-Expression wurde 24 Stunden nach der CG-Stimulation untersucht.
Ein CG von 2.400 mal g induzierte signifikant die SOX9-mRNA-Expression. Um die Expression von Chondrogenese-bezogenen Genen zu bewerten, wurde die Gesamt-RNA aus unstimulierten ASCs extrahiert, die zentrifugiert oder mit TGF-beta-on behandelt worden waren. Wie hier zu sehen ist, induziert die CG-Stimulation die Kollagen-Typ-2- und Aggrecan-Expression.
Die Überexpression von Kollagen Typ-2 in ASC's, die mit CG behandelt wurden, wurde durch Immunfluoreszenz unter Verwendung eines Antikörpers gegen Kollagen Typ-2 in einem Alexa Fluor 594 konjugierten Sekundärantikörper bestätigt. Um die Wirkung von CG auf die Chondrogenese-bedingte EZM-Überexpression zu bestimmen, wurden ASCs mit TGF-beta-on als Positivkontrolle behandelt. Bei der Negativkontrolle handelte es sich um eine Pelletkultur, die keiner CG-Beladung oder TGF-beta-on-Behandlung unterzogen wurde.
Die Überexpression der Chondrogenese-bedingten EZM wurde in Sphäroidpellets, die aus zentrifugierten ASC's bestehen, unter Verwendung von Safranin o und Alcianblau-Färbung untersucht. Glykosaminoglykan, ein Hauptbestandteil des Gelenkknorpels, wurde durch Alcianblau blau oder durch Safranin o orange gefärbt. Nach 14-tägiger Mikromassenkultur wurde die Chondrozytenkondensation anhand der Größe der Aggregate bewertet.
Die Größe jedes Aggregats, das durch CG erzeugt wurde, betrug etwa 0,5 Millimeter. Einmal gemeistert, kann diese Technik in 30 Minuten durchgeführt werden, wenn sie richtig ausgeführt wird. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie die chondogene Differenzierung von Stammzellen mithilfe der Zentrifugalgravitation induziert wird.
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Übersicht
Dieser Artikel stellt ein Protokoll zur Induktion der chondrogenen Differenzierung von fettgewebsabstammenden Stammzellen (ASCs) unter Verwendung von Zentrifugalbeschleunigung (CG) vor. Die Methode unterstreicht das Potenzial mechanischer Belastung bei der Knorpelreparatur, indem sie die Hochregulation von SOX9 fördert, was zur Entwicklung chondrogener Phänotypen führt.
Wesentliche Studienbestandteile
Bereich der Wissenschaft
- Stammzellbiologie
- Gelenkknorpelreparatur
- Einfluss mechanischer Belastung
Hintergrund
- Die chondrogene Differenzierung ist entscheidend für die Knorpelreparatur.
- Stammzellen aus Fettgewebe (ASCs) sind eine aussichtsreiche Quelle für regenerative Therapien.
- Mechanische Kräfte können die Differenzierung von Stammzellen beeinflussen.
- SOX9 ist ein zentraler Transkriptionsfaktor in der Chondrogenese.
Zweck der Studie
- Entwicklung einer Methode zur Induktion der chondrogenen Differenzierung von ASCs.
- Untersuchung der Wirkung der Zentrifugalkraft auf die Differenzierung von Stammzellen.
- Bereitstellung eines zytokinfreien Ansatzes zur Knorpelreparatur.
Verwendete Methoden
- Gewinnung von ASCs aus Kulturschalen.
- Anwendung von Zentrifugalkraft, um die Differenzierung zu induzieren.
- Überprüfung der Expression chondrogener Marker.
- Demonstration des Verfahrens durch Laborpersonal.
Hauptergebnisse
- Erfolgreiche Induktion der chondrogenen Differenzierung in ASCs.
- Beobachtete Hochregulation von SOX9 nach der Behandlung.
- Entwicklung chondrogener Phänotypen bestätigt.
- Potentielle Anwendungen in anderen Differenzierungswegen festgestellt.
Schlussfolgerungen
- Die Zentrifugalkraft ist eine wirksame Methode zur Induktion der chondrogenen Differenzierung.
- Diese Technik könnte Strategien zur Knorpelreparatur verbessern.
- Weitere Forschung könnte ihre Anwendung auf andere Prozesse der Stammzelldifferenzierung ausweiten.
Häufig gestellte Fragen
Ausschlaggebende Bedeutung für die Industrie
Die mechanische Induktion der chondrogenen Differenzierung bietet eine zytokinfreie Alternative für die Knorpelreparatur und verringert Kontaminationsrisiken sowie die Prozesskomplexität bei stammzellbasierten Therapien. Dieser Ansatz unterstützt die Zielvalidierung, indem er die funktionelle Beurteilung des chondrogenen Potenzials in fettgewebsabgeleiteten Stammzellen unter definierten biomechanischen Bedingungen ermöglicht. Die Methode stellt ein skalierbares, reproduzierbares System für die Absicherung von Knorpelregenerationsstrategien in einem frühen Stadium bereit.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Wissenschaftlicher Wert: Ermöglicht die Untersuchung der SOX9-Überexpression als mechanistischen Endpunkt für die chondrogene Differenzierung von Stammzellen.
- Operativer Wert: Bietet ein zytokinfreies Induktionssystem, das die Variabilität und das Kontaminationsrisiko in Differenzierungsassays minimiert.
- Prädiktiver Wert: Ermöglicht die Beurteilung des chondrogenen Phänotyps durch die Expression von Markern (ACAN, COL2A1) und die Bildung von Aggregaten.
Screening und Assay-Entwicklung
- Assay-Bereitschaft: Erzeugt standardisierte chondrogene Aggregate, die für die nachgeschaltete Analyse der extrazellulären Matrix und histologische Untersuchungen geeignet sind.
- Quantitative Auswertung: Ermöglicht die Messung der Ablagerung von Glykosaminoglykanen mittels Safranin-O- und Alcianblau-Färbung.
- Skalierbarkeit: Verwendet herkömmliche Zentrifugiergeräte, wodurch die Integration in bestehende Laborabläufe erleichtert wird.
Translationale und präklinische Forschung
- Krankheitsrelevanz: Modelliert frühe chondrogene Ereignisse, die für Strategien zur Reparatur von Gelenkknorpel entscheidend sind.
- Mechanistische Risikominimierung: Vermeidet Marker der hypertrophen Differenzierung (COL10) und unterstützt so die Evaluierung stabiler Chondrozyten-Phänotypen.
- Translationale Kontinuität: Verbindet die in-vitro-Differenzierung mit der präklinischen Bewertung durch die Bildung von Sphäroid-Pellets und histologische Validierung.
Pipeline- und Workflow-Integration
Die Methode fügt sich in den Entdeckungsprozess von der Target-Validierung bis zur präklinischen Modellierung ein, indem sie ein biomechanisches Induktionssystem für die Chondrogenese bereitstellt.
- Entdeckungsbiologie: Überprüft die Hypothese, dass mechanische Belastung biochemische Induktoren bei der Differenzierung von Stammzellen ersetzen kann.
- Screening: Erzeugt reproduzierbare Mikromassenkulturen zur Untersuchung von Substanzen oder Bedingungen in der Chondrogenese.
- Analytik: Liefert quantifizierbare Ergebnisse, einschließlich der Expression von SOX9, ACAN, COL2A1 und der Intensität histologischer Färbungen.
- Translationale Forschung: Unterstützt den Übergang zu präklinischen Modellen, indem stabile chondrogene Pellets ohne hypertrophe Marker erzeugt werden.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Kann mithilfe derselben zentrifugalen Schwerkraftplattform auf andere Differenzierungslinien (osteogen, fibrogen) übertragen werden.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Verringert mechanistische Mehrdeutigkeiten, indem mechanischer Stress als Differenzierungsinduktor isoliert wird.
- Operationaler Wert: Beseitigt die Abhängigkeit von Zytokinen und vereinfacht dadurch die Reagentienlogistik sowie die Chargenvariabilität.
- Strategischer Wert: Verbessert Entscheidungen über Fortführung oder Abbruch durch frühzeitige Beurteilung des chondrogenen Potenzials von Stammzellquellen.
- Portfolio-Wirkung: Unterstützt die risikoadjustierte Priorisierung von Kandidaten für Knorpelreparatur durch prädiktive phänotypische Screening-Verfahren.
Durchführungsaspekte
- Erfordert Fachkenntnisse in der Kultivierung von Stammzellen und der histologischen Aufarbeitung.
- Hängt von dem Zugang zu kalibrierten Zentrifugen ab, die 2.400 × g erreichen können.
- Erfordert die Standardisierung der Zellansaatdichte und der Zentrifugationsdauer über verschiedene Labore hinweg.
- Erfordert eine Anpassung der chondrogenen Mediumzusammensetzung bei Verwendung unterschiedlicher Stammzellquellen.
- Auf In-vitro-Modelle beschränkt; ersetzt nicht die In-vivo-Validierung der Knorpelintegration oder -funktion.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
0:54
Centrifugal Gravity Loading
2:22
Pellet Culture
3:12
Micromass Culture
4:10
Paraffin-embedding Cell Pellets
5:59
Results: Upregulation of Chondrogenic Differentiation Markers in Adipose-derived Stem Cells Following Centrifugal Gravity Loading
7:59
Conclusion
