Erzeugung von Sphäroiden aus verschiedenen Chondrozyten unter Verwendung von niedrigadhäsiven Bedingungen unter Schwerkraft und selbstgemachten Mini-Bioreaktoren

Die Knorpelreparatur bei chronischen Gelenkerkrankungen erfordert fortschrittliche zellbasierte Therapien, um geschädigtes Gewebe effizient zu regenerieren. Dieses Protokoll bietet eine Schritt-für-Schritt-Methode zur Differenzierung von induzierten pluripotenten Stammzellen in Chondrozyten-basierte Sphäroide und unterstützt so Tissue Engineering und Zelltherapieanwendungen. Die Knorpelreparatur bei chronischen Gelenkerkrankungen erfordert fortschrittliche zellbasierte Therapien, um geschädigtes Gewebe ausreichend zu regenerieren.

Dieses Protokoll bietet eine Schritt-für-Schritt-Methode zur Differenzierung von induzierten pluripotenten Stammzellen in Chondrozyten-basierte Sphäroide und unterstützt so Tissue Engineering und Zelltherapieanwendungen. Die größten Herausforderungen sind die Minimierung der Kollagenexpression vom Typ 1 in iPSC-abgeleiteten Zellen, um fibrösen Knorpel zu verhindern, die Schaffung von Bedingungen für die Bildung von reifem Highline-Knorpel, die Verbesserung der 3D-Kulturmethoden für die Sphäroidstabilität und die Entwicklung skalierbarer Ansätze für die Herstellung klinischer Volumina von zellulärem Material. Das Protokoll bietet einen Vorteil, indem es iPSCs als alternative Quelle für Chondrozyten verwendet und so eine skalierbare Produktion ohne invasive Verfahren ermöglicht.

Es sorgt für eine bessere Erhaltung des Chondrozyten-Phänotyps durch 3D-Kultivierung und ahmt die natürliche Knorpelentwicklung nach, was dazu führt, dass die Zellen den nativen Chondrozyten sehr ähnlich sind und eine hohe Expression von knorpelspezifischen Markern aufweisen. Entwicklung effektiver Methoden zur Verbesserung der Reife und Funktionalität von iPSC-abgeleiteten Chondrozyten, zur Gewährleistung der Langzeitstabilität in vivo, zur Herstellung von fibrosierten dreidimensionalen Kulturmaterialien und zur Entwicklung einer skalierbaren Produktion von zellulärem Material für die klinische Anwendung. Sterilisieren Sie die Schere zunächst 30 Minuten lang in einem Autoklaven bei 121 Grad Celsius bei 15 Pfund pro Quadratzoll.

Nachdem die Schere getrocknet ist, schneiden Sie die Zentrifugenröhrchen in Ringe, die sieben bis acht Millimeter hoch sind. Zerkleinern Sie nun unbehandelte oder mikrobiologische Petrischalen mit geringer Haftung mit einem geeigneten Zerkleinerungswerkzeug in kleine Stücke. Lösen Sie etwa ein Gramm Kunststoffpartikel in 10 Millilitern Chloroform über Nacht in einem Abzug.

Überprüfen Sie die Viskosität der flüssigen Kunststofflösung, um sicherzustellen, dass sie zum Pipettieren geeignet ist. Wenn die Lösung zu dünnflüssig ist, fügen Sie ein bis drei Gramm zusätzliche Kunststoffpartikel hinzu. Wenn es zu dickflüssig wird, verdünnen Sie es mit etwa fünf Millilitern Chloroform.

Platzieren Sie einen Autoklav-Kunststoffring in der Mitte einer 60-Millimeter-Petrischale. Tragen Sie dann flüssigen Kunststoff in den Ring auf, um einen Kunststoffknopf zu bilden. Lassen Sie das Geschirr zwei bis drei Stunden lang unbedeckt in einer Laminar-Flow-Haube trocknen.

Setzen Sie das Geschirr nach dem Trocknen 20 bis 30 Minuten lang ultravioletter Strahlung aus. Besorgen Sie sich zunächst die modifizierten Petrischalen mit Kunststoffknöpfen. Waschen Sie zwei Tage nach der Knorpelentnahme Knorpelstücke in Hanks Lösung mit 60-Millimeter-Petrischale.

Schneiden Sie dann den Knorpel mit einer Autoklavenschere in Stücke mit einem Durchmesser von etwa ein bis zwei Millimetern. Übertragen Sie Knorpelstücke in ein 15-Milliliter-Röhrchen und verdauen Sie sie in einer 0,01%igen Kollagenase-Typ-2-Lösung in DMEM für acht bis 12 Stunden in einem orbitalen Shaker-Inkubator. Nach dem Aufschluss die Knorpelfragmente mit DMEM zugeben und das Röhrchen bei 300 g 10 Minuten zentrifugieren.

Nachdem Sie die Waschlösung verworfen haben, resuspendieren Sie die Fragmente in einem Chondrozyten-Kulturmedium und säen Sie sie auf einen mit 0,1%iger Gelatinelösung vorbeschichteten selbstklebenden T25-Kolben und inkubieren Sie. Als nächstes kultivieren Sie induzierte pluripotente Stammzellen in Sechs-Well-Platten, die mit einer Matrix vorbeschichtet sind, die extrazelluläre Proteine enthält. Um die Differenzierung in Richtung der chondrozytären Linie zu initiieren, kultivieren Sie iPSCs in den ersten zwei Tagen in Medium A.

Ersetzen Sie am dritten Tag Medium A durch eine Lösung, die CHIR-99021 und Rho-Kinase-Inhibitor ausschließt, während alle anderen Komponenten unverändert bleiben. Übertragen Sie an Tag 10 Chondrozyten-ähnliche Zellen auf Medium B, das zur Erleichterung der Chondrogenese formuliert ist, und schmelzen Sie dann 1,5 % Argarose in einer Mikrowelle für etwa 60 bis 90 Sekunden bei 700 Watt. Nach dem Verflüssigen geben Sie 75 Mikroliter der Agarose in jede Vertiefung einer 96-Well-Zellsuspensionskulturplatte und lassen Sie sie bei Raumtemperatur aushärten.

Geben Sie anschließend 150 Mikroliter DMEM in jede Vertiefung und inkubieren Sie die Platte mindestens 12 Stunden lang in einem Kohlendioxid-Inkubator. Beobachten Sie an Tag 12 die phänotypischen Veränderungen, die mit der Androgenese verbunden sind, um mit der Sphäroid-Initiation fortzufahren. Trennen Sie die Zellen mit einer Konfluenz von 80 % von der Platte mit einer 0,05 %igen Trypsinlösung.

Nach Zugabe gleicher Volumina DMEM mit 10 % FBS werden die Zellen in ein 15-Milliliter-Röhrchen überführt und fünf Minuten lang bei 200 g zentrifugiert. Die Zellen werden in einem Milliliter Medium B resuspendiert und in einen 75 Quadratzentimeter großen Zellkulturkolben überführt, der mit 0,1%iger Gelatinelösung vorbeschichtet ist. Sobald die Zellen eine Konfluenz von 80 % als Monoschicht erreicht haben, lösen Sie sie wieder mit Trypsin ab und resuspendieren Sie sie in Medium B.Geben Sie nun die Zellen in eine 96-Well-Platte, die mit 1,5 % Agarose bei einer Dichte von 100.000 Zellen pro Well beschichtet ist, zusammen mit 150 Mikrolitern Medium B. Inkubieren Sie die Zellen mindestens einen Tag und maximal drei Tage, bis sich Sphäroide bilden.

Übertragen Sie dann die Sphäroide aus den Vertiefungen mit einer Ein-Milliliter-Pipettenspitze mit abgeschnittenem Ende auf ein 15-Milliliter-Röhrchen. Lassen Sie die Sphäroide zwei bis drei Minuten einwirken und entfernen Sie den Überstand. Tauchen Sie nun die Sphäroide in frisch aufgetaute, unverdünnte Basalmembranmatrixlösung, die bei vier Grad Celsius temperiert ist.

Nach 30 Minuten zentrifugieren Sie das Röhrchen eine Minute lang bei 100 g, um die Sphäroide zu sammeln. Zum Schluss werden die Sphäroide in die vorbereiteten Mini-Bioreaktoren überführt und sechs Milliliter Medium B hinzugefügt.Stellen Sie den Mini-Bioreaktor in einen Kohlendioxid-Inkubator. Nach 19 Tagen der Differenzierung exprimierten 99 % der Zellen die chondrogenen Marker Aggrecan, Kollagen Typ eins, Kollagen Typ zwei und SOX9.

Qualitativ hochwertige Chondrosphären wurden als solche mit einer Expression von mindestens 90 bis 95 % chondrozytärer Genmarker identifiziert, die durch Genexpressionsanalyse am 30. Tag der Differenzierung bewertet wurden. Reife Sphäroide zeigten eine konsistente Morphogenese und wuchsen nach zwei Monaten auf einen typischen Durchmesser von ein bis zwei Millimetern an, wobei größere Sphäroide zentrale Zonen mit Hohlräumen oder Nekrosen zeigten.