Ein Protein Herstellungsverfahren für die Hochdurchsatz-Identifizierung von Proteinen Interagieren mit nuklearen Cofaktor LC-MS / MS-Analyse
24. Januar 2017
Wir haben ein Verfahren zur Reinigung von Koregulierung Wechselwirkung Proteine etabliert unter Verwendung der LC-MS / MS-System.
Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist die Identifizierung von Proteinen, die mit einem nuklearen Cofaktor interagieren, mittels LC-MS/MS-Analyse. Diese Methode kann helfen, Schlüsselfragen im Zusammenhang mit transkriptionellen Mechanismen im Bereich der Genregulation zu beantworten. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass wir die Proteine identifizieren können, die mit einem nukleären Cofaktor interagieren.
Darüber hinaus ermöglicht uns diese Methode, die transkriptionellen Regulationsmechanismen der anvisierten nuklearen Faktoren besser zu verstehen. Ernten Sie HEK 293-Zellen, die flaggenmarkiertes ARIP4 exprimieren, 36 Stunden nach der Transvektion, indem Sie das Zellblatt mit eiskaltem PBS waschen und die Zellen mit einem Zellschaber sammeln. Füllen Sie die Zellen in ein 1,5-Milliliter-Röhrchen und zentrifugieren Sie sie dann bei 8000 g für zwei Minuten bei vier Grad Celsius.
Aspirieren Sie den Überstand und suspendieren Sie das Zellpellet im Fünffachen des Pelletvolumens von High Salt Buffer. Drehen Sie die Mischung 20 Minuten lang bei vier Grad Celsius. Nach 20 Minuten Drehung zentrifugieren Sie das Röhrchen bei 17.700 g für 10 Minuten bei vier Grad Celsius.
Übertragen Sie anschließend die Überstände in ein neues Zwei-Milliliter-Röhrchen und fügen Sie Verdünnungspuffer auf das dreifache Volumen des Überstands hinzu. Führen Sie eine weitere Petrifugation durch und übertragen Sie dann den Überstand in ein neues Zwei-Milliliter-Röhrchen. Während der 10-minütigen Zentrifugation werden 50 Mikroliter Anti-Flaggen-Kügelchen mit PBS gewaschen.
Dann zentrifugieren Sie das Röhrchen bei 2000 g für eine Minute bei vier Grad Celsius. Entfernen Sie den Überstand und wiederholen Sie die Waschschritte zuerst mit 1 molaren Glycinhydrochlorid und dann mit einem molaren Trishydrochlorid. Dann zweimal mit salzarmem Puffer waschen.
Mischen Sie anschließend 50 Mikroliter gewaschene Kügelchen mit Ganzzellextrakten. Drehen Sie die Mischung vorsichtig vier Stunden lang bei zwei bis vier Grad Celsius. Verwenden Sie dann eine abgestumpfte Spitze, um die Probe in eine Mikrospinsäule zu überführen, und lassen Sie die Lösung in ein 1,5-Milliliter-Röhrchen tropfen.
Den Durchfluss in flüssigem Stickstoff einfrieren und bei minus 80 Grad Celsius lagern. Als nächstes waschen Sie die Fahnenperlen fünfmal mit salzarmem Puffer. Zum Eluieren die Säule in ein 1,5-Milliliter-Röhrchen geben und eine Minute lang bei 2000 g zentrifugieren, um die Kügelchen zu trocknen.
Verschließen Sie den Boden der Säule und fügen Sie dann 50 Mikroliter 1 molares Glycinhydrochlorid hinzu. Schütteln Sie die Mischung vorsichtig 10 Minuten lang bei Raumtemperatur. Nach 10 Minuten die Säule in ein neues 1,5-Milliliter-Röhrchen setzen und eine Minute lang bei 2000 g zentrifugieren.
Neutralisieren Sie die eluierte Lösung mit 10 Mikrolitern eines molaren Trishydrochlorids und mischen Sie sie gut durch Pipettieren und Vortexen. Fügen Sie 50 Mikroliter 100 millimolare Ammoniumbicarbonat hinzu. 10 Mikroliter Acetonitril, zwei Mikroliter Dithiothreitol und 50 Mikroliter neutralisierte Probe.
30 Minuten bei 56 Grad Celsius inkubieren. Nach der Inkubation lassen Sie die Probe 10 Minuten lang bei Raumtemperatur. Geben Sie dann 10 Mikroliter 333 millimolare Iodacetamid in die Probe und inkubieren Sie sie 30 Minuten lang im Dunkeln bei 37 Grad Celsius. Geben Sie 10 Mikroliter Trypsin in die Mischung und inkubieren Sie sie über Nacht bei 37 Grad Celsius.
Am nächsten Tag wird das Endprodukt zur Analyse zu einer LC-MS/MS-Anlage oder zu einem Massenspektrometrielabor eines Drittanbieters transportiert. Dieses Bild zeigt die Silberfärbung von Flaggenepitopen, die mit ARIP4 markiert sind, die in HEK 293-Zellen exprimiert werden, nach Immunfällung mit einem flaggenspezifischen Antikörper und Trennung durch Elektrophorese. Als Kontrolle wurde eine Scheinreinigung an HEK 293-Zellen durchgeführt, die keine exogenen Proteine exprimierten.
Mit unserer Methode ist es möglich, mutmaßliche nukleäre Cofaktoren über ihren Transkriptionsfaktor von Interesse zu identifizieren und unser Verständnis der transkriptionellen Regulationsmechanismen weiter zu verbessern.
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Übersicht
Dieser Artikel stellt ein detailliertes Protokoll zur Identifizierung von Proteinen vor, die mit nukleären Koregulatoren über die LC-MS/MS-Analyse interagieren. Die Methode umfasst die Immunpräzipitation eines mit einem Flag-Tag markierten nukleären Koregulators aus HEK-293-Zellen, gefolgt von einer Massenspektrometrie, um proteinwechselwirkungen aufzudecken, die für die transkriptionelle Regulation von Bedeutung sind. Dieser Ansatz ermöglicht es Forschern, die komplexen Netzwerke aufzuklären, die die Genexpression steuern.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Molekularbiologie
- Proteomik
- Transkriptionelle Regulation
Hintergrund
- Transkriptionelle Koregulatoren sind entscheidend für die effiziente Regulation der nukleären Chromatinstruktur.
- Koregulatoren interagieren mit Transkriptionsfaktoren, modifizieren Histone und Proteine und können die Chromatinkonformation verändern.
- Das Verständnis von Protein-Protein-Interaktionen innerhalb dieser Netzwerke ist entscheidend, um genregulatorische Mechanismen zu entschlüsseln.
- LC-MS/MS ist eine etablierte Methode zur Identifizierung von Protein-Bindungspartnern.
Zweck der Studie
- Entwicklung einer schnellen und zuverlässigen Methode zur Identifizierung von Proteinen, die mit nukleären Koregulatoren interagieren.
- Vereinfachung der Hochdurchsatzanalyse von Protein-Komplexen, die an der transkriptionellen Regulation beteiligt sind.
- Verbesserung des Verständnisses der molekularen Mechanismen, die der Kontrolle der Genexpression zugrunde liegen.
Verwendete Methoden
- Expression von Flag-markiertem ARIP4 in HEK-293-Zellen.
- Sammlung und Lyse der Zellen mit Puffer mit hohem Salzgehalt.
- Immunpräzipitation mit Anti-Flag-Beads zur Isolierung von Protein-Komplexen.
- Schrittweise Waschung und Elution der gebundenen Proteine.
- Proteolytische Spaltung mit Trypsin und Probenvorbereitung für die LC-MS/MS-Analyse.
- Analyse von Proteinwechselwirkungen mittels Massenspektrometrie.
Hauptergebnisse
- Erfolgreiche Isolierung von Flag-markiertem ARIP4 und assoziierten Proteinen aus HEK-293-Zellen.
- Silberfärbung bestätigte das Vorhandensein immunpräzipitierter Proteine.
- Kontrollexperimente bestätigten die Spezifität des Aufreinigungsverfahrens.
- LC-MS/MS ermöglichte die Identifizierung putativer nukleärer Cofaktor-Bindungspartner.
Schlussfolgerungen
- Das beschriebene Protokoll identifiziert effektiv Proteine, die mit nukleären Koregulatoren interagieren.
- Diese Methode trägt zur Erforschung transkriptioneller Regulationsmechanismen bei.
- Sie bietet eine Grundlage für die weitere Untersuchung von Proteinnetzwerken in der Genregulation.
Häufig gestellte Fragen
Ausschlaggebende Bedeutung für die Industrie
Die Hochdurchsatz-Identifizierung von Wechselwirkungen zwischen nukleären Koregulatorproteinen mittels LC-MS/MS ist entscheidend, um frühe Entdeckungsphasen abzusichern und transkriptionelle regulatorische Netzwerke aufzuklären. Dieser Arbeitsablauf ermöglicht es Biopharma-Teams, mechanistische Hypothesen zu überprüfen und Zielstrukturen basierend auf direkten Nachweisen von Protein-Protein-Wechselwirkungen zu priorisieren. Die Integration robuster Interaktom-Kartierungen in der Entdeckungsphase stärkt die Vorhersagegenauigkeit und unterstützt Entscheidungen zur Portfolio-Priorisierung.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Ermöglicht die systematische Identifizierung nukleärer Korezeptor-Bindungspartner zur funktionellen Zielvalidierung.
- Unterstützt die mechanistische Ent风险bewertung durch Klärung transkriptioneller regulatorischer Signalwege.
- Liefert direkte Nachweise für Proteininteraktionsnetzwerke, die für die Genregulation relevant sind.
- Erleichtert die Priorisierung von Zielstrukturen mit validierten molekularen Wechselwirkungen.
Screening und Assay-Entwicklung
- Bereitet validierte Protein-Komplexe für die nachgeschaltete quantitative LC-MS/MS-Analyse vor.
- Standardisiert die Immunpräzipitation und die Probenvorbereitung für eine reproduzierbare Interaktom-Profilierung.
- Erzeugt quantitative Daten, die die Assay-Entwicklung und die Bereitschaft für Screening-Untersuchungen unterstützen.
- Ermöglicht eine zuverlässige Bewertung der Wirkung von Verbindungen auf Protein-Protein-Interaktionen.
Translationale und präklinische Forschung
- Koppelt Interaktomdaten mit krankheitsrelevanten transkriptionellen Mechanismen, wenn nukleäre Cofaktoren in die Pathologie involviert sind.
- Unterstützt die Kontinuität von der Entdeckung bis zur präklinischen Validierung durch die Kartierung regulatorischer Proteinnetzwerke.
- Ermöglicht risikoadjustierte Entscheidungen über die Weiterentwicklung basierend auf mechanistischen Erkenntnissen.
Pipeline- und Workflow-Integration
Diese Proteinpräparation und LC-MS/MS-Arbeitsabfolge ist an der Schnittstelle zwischen früher Entdeckung und Identifizierung von Wirkstoffkandidaten angesiedelt und liefert grundlegende Interaktomdaten für nachgeschaltete translationale Forschung.
- Entdeckungsbiochemie: Unterstützt die Hypothesenprüfung und Klärung von Signalwegen durch Abbildung nukleärer Koregulator-Interaktionen.
- Screening: Liefert reproduzierbare, quantitative Ergebnisse für die Assay-Entwicklung und die Wirkstoff-Screening.
- Analytik: Ermöglicht die Identifizierung und Quantifizierung von Protein-Komplexen mittels massenspektrometrischer Methoden.
- Translationale Forschung: Ermöglicht gegebenenfalls die Abstimmung molekularer Interaktionsdaten mit Krankheitsmodellen.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Schafft einen skalierbaren und wiederverwendbaren Workflow zur Kartierung von Interaktomen über verschiedene Zielstrukturen und Forschungsprogramme hinweg.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Erhöht die Vorhersagesicherheit und verringert mechanistische Unklarheiten bei der Zielvalidierung.
- Operativer Wert: Standardisiert die Isolierung von Protein-Komplexen und die LC-MS/MS-Analyse, um Reproduzierbarkeit und Skalierbarkeit zu gewährleisten.
- Strategischer Wert: Verbessert Entscheidungen über Fortführung oder Einstellung von Projekten sowie die Kapitaleffizienz, indem die Weiterentwicklung auf Daten direkter Interaktionen gestützt wird.
- Portfolio-Wirkung: Ermöglicht eine risikoadjustierte Priorisierung basierend auf validierten molekularen Mechanismen.
Durchführungsaspekte
- Setzt Fachkenntnisse in Immunpräzipitation, Proteinchemie und LC-MS/MS-Analytik voraus.
- Benötigt Zugang zu Massenspektrometrie-Geräten und analytischer Infrastruktur.
- Erfordert die Standardisierung von Probenvorbereitung und Datenanalyseprotokollen über mehrere Arbeitsgruppen hinweg.
- Kann an verschiedene nukleäre Koregulatoren und markierte Proteinsysteme angepasst werden, sofern die Protokolle optimiert werden.
- Hängt von der Spezifität und Qualität des Antikörpers für eine zuverlässige Immunpräzipitation ab.
