Ein Protokoll für die Identifizierung von Protein-Protein-Wechselwirkungen Basierend auf

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments besteht darin, Proteine zu identifizieren, die spezifisch mit einem gegebenen Zielprotein in Zelllysaten interagieren, die lösliche und Membranproteine enthalten. Zunächst erfolgt eine vollständige metabolische Markierung von Chlamydomonas-Zellen mit Stickstoff-14 und Stickstoff-15 sowie die Herstellung von Zelllysaten mit und ohne ein TP. Ein optionaler Vernetzungsschritt dient der Stabilisierung vorübergehender Protein-Protein-Interaktionen. Anschließend werden die Zelllysate in Fraktionen getrennt, angereichert an unlöslichen und Membranproteinen, aus denen das Zielprotein und seine spezifischen Interaktionspartner gewonnen werden.

Ein Kontrollprotein und kontaminierende Proteine werden immunpräzipitiert und eluiert. Nun mischen Sie die immunpräzipitierten Proteine, verdauen sie dreifach und analysieren sie mittels tandem LCMS. Die Ergebnisse unterscheiden zwischen echten und falschen Interaktionspartnern, indem sie unterschiedliche Stickstoff-Isotopenverhältnisse, 14-Stickstoff-15-Peptid-Verhältnisse für Proteine, die spezifisch mit dem Zielprotein interagieren, und gleiche Stickstoffverhältnisse zeigen.

14 Stickstoff-15-Peptid-Verhältnisse für das Zielprotein, das Kontrollprotein und kontaminierende Proteine. Die Methode der Wahl zur Analyse von Protein-Protein-Interaktionen besteht darin, das gewünschte Protein direkt mit seinen Interaktionspartnern aus Zelllysaten, in denen beide in ihrer nativen Konformation und Konzentration vorliegen, immunpräzipitieren zu lassen.

Jedoch werden dabei auch kontaminierende Proteine präzipitiert, hauptsächlich weil sie mit den Antikörpern interagieren, da moderne Massenspektrometer äußerst empfindlich sind. Sie werden eindeutig auch die kontaminierenden Proteine identifizieren und es somit unmöglich machen, echte Interaktionspartner von Hintergrundsignalen zu unterscheiden. Dieses Problem wird durch die hier gezeigte Technik umgangen, die auf 15N-metabolischer Markierung, immunpräzipitativer Affinitätsmodulation – hier vermittelt durch den ATP-Zustand – und quantitativer Massenspektrometrie basiert.

Die Technik wird von Stefan SCH Malinger gezeigt, der ein erfahrener Doktorand in meinem Labor ist. Nach der Markierung der Zellen über 10 Generationen werden jeweils zwei Aliquote der mit Stickstoff-14 und Stickstoff-15 markierten Chlamydomonas-Zellen in 4G-SA-Röhrchen überführt, durch Zentrifugation gesammelt, die Pellets in zwei Milliliter eiskaltem Lysepuffer resuspendiert und die Suspensionen in 15-Milliliter-Falcon-Röhrchen übertragen. Die verbleibenden Zellen werden mit jeweils einem zusätzlichen Milliliter Lysepuffer pro Eloqua gesammelt. 50 Mikroliter 25×-Proteaseinhibitor und 12,5 Mikroliter einmolar Magnesiumchlorid zugeben, die Proben viermal 20 Sekunden lang auf Eis sonifizieren, jeweils mit 20-sekündigen Pausen zur Kühlung, um eine vollständige Zelllyse zu gewährleisten.

Bereiten Sie vier sechs Milliliter schwere Saccharose-Polster in SW 41 TI Dünnwandröhrchen vor. Geben Sie das gesamte Volumen der Zelllysate vorsichtig auf die Saccharose-Polster. Wägen Sie mit Lysepuffer aus und zentrifugieren Sie, um lösliche Protein-Komplexe von Membranen zu trennen.

Überführen Sie die löslichen Protein-Komplexe von der Oberseite der Gradienten in vier 15-Milliliter-Falcon-Röhrchen, wobei sichergestellt werden muss, dass keine Bestandteile des Saccharosepolsters mitübertragen werden. Geben Sie dann jedem Probenansatz Triton X-100 10 % bis zu einer Endkonzentration von 0,5 % hinzu, mischen Sie vorsichtig und ergänzen Sie Lysepuffer auf ein Gesamtvolumen von sieben Millilitern.

Für SDS-Gelelektrophorese und Immunblot-Analysen. 70 Mikroliter jedes löslichen Zelllysats in ein frisches 1,5-Milliliter-Kunststoffröhrchen abgeben und 70 Mikroliter 2× SDS-Probelösung zugeben. Anschließend die Saccharosecushions aus den dünnwandigen SW-41-TI-Röhrchen verwerfen und zu jedem Pellet 3 Milliliter Lysepuffer hinzufügen.

Geben Sie ein Milliliter 10 % Triton X-100 hinzu, um eine Endkonzentration von 2 % zu erreichen. Nach dem Auflösen jedes Pellets durch Beschallung fügen Sie Puffer zur Zelllyse hinzu, um ein Gesamtvolumen von fünf Millilitern zu erreichen, und zentrifugieren Sie die Probe. Wie zuvor sammeln Sie die oberen Fraktionen der Membranproteinkomplexe in 15-Milliliter-Falcon-Röhrchen. Geben Sie Lysispuffer mit 2 % Triton X-100 hinzu, um ein Endvolumen von sieben Millilitern zu erreichen.

Verwenden Sie 70 Mikroliter dieser Proben für die SDS-Gelelektrophorese und immunologische Blutanalysen. Puffern Sie zunächst das antikörpergekoppelte Protein an. Eine Sero-Beads-Lösung mit zwei Vier-Milliliter-Waschschritten in Lysepuffer auf acht Milliliter verdünnen und aliquotieren.

Ein Milliliter der Suspension wird jeweils in acht 15-Milliliter-Falcon-Röhrchen gegeben, die lösliche oder membranassoziierte Protein-Komplexe aus stickstoff-14- und stickstoff-15-markierten Zellen mit oder ohne TP enthalten, und zwei Stunden bei vier Grad Celsius auf einem Röhrchenroller inkubiert, um die Protein-Komplexe auszufällen. Die Kügelchen werden durch Zentrifugation pelletiert, das Überstand wird verworfen, wobei eine kleine Flüssigkeitsmenge über den Kügelchen verbleibt, um eine Kontamination durch an die Kunststoffwände adhärierende Proteine zu vermeiden. Die Proben werden in frische 1,5-Milliliter-Konusröhrchen überführt, um alle verbleibenden Kügelchen aus den Falcon-Röhrchen zu sammeln. Zu jedem Ansatz werden weitere 0,8 Milliliter Puffer mit 0,1 % Triton zugegeben, vorsichtig verwirbelt, kurz zentrifugiert und der Puffer mit den Restkügelchen in die Eppendorf-Röhrchen überführt. Nach mehreren Waschschritten werden die Proben 15 Sekunden bei 16.100 × g und vier Grad Celsius zentrifugiert.

Entfernen Sie zuerst die Probenüberstände mit einer normalen Pipette. Danach entfernen Sie jeglichen verbleibenden Überstand vollständig mit der 50-Mikroliter-Hamilton-Spritze. Geben Sie zu jeder Probe 100 Mikroliter frisch zubereiteten Elutionspuffer hinzu und inkubieren Sie die Proben in einem Thermomixer bei 800 U/min, zentrifugieren Sie 15 Sekunden bei 16.100 × g und 25 °C.

Überführen Sie nun jedes Überstand auf ein frisches Röhrchen, indem Sie eine saubere 50-Mikroliter-Hamilton-Spritze verwenden. Geben Sie außerdem 50 Mikroliter Elutionspuffer zu den Perlen hinzu, genauso wie zuvor bei den Proben, und vereinigen Sie die jeweiligen Eluate. Denken Sie daran, jeweils 30 Mikroliter aller Proben-EITs für die SDS-Page- und Immuno-Blot-Analysen zurückzuhalten.

Vereinigen Sie nun die eluierten Präzipitate aus den mit ATP behandelten und nicht behandelten, mit Stickstoff-14 und Stickstoff-15 markierten löslichen und membranständigen Proteinen. Führen Sie anschließend die Reduktion, Alkylierung und den initialen Verdau in harnstoffhaltigem Puffer wie in der begleitenden Veröffentlichung beschrieben durch. Setzen Sie den Verdau dann im Triptych-Verfahren auf einer Rotationsrolle für mindestens 16 Stunden fort.

Bei 37 Grad Celsius. Pelletieren Sie die Trypsinkügelchen durch eine fünfundzwanzigminütige Zentrifugation bei 16.100 × g und 4 Grad Celsius. Überführen Sie die Überstände in frische 2-Milliliter-Eppendorf-Röhrchen.

Waschen Sie die alten Röhrchen mit 50 Mikrolitern 20 Millimolar Ammoniumbicarbonat, 0,5 % Essigsäure und vereinigen Sie sie mit den ersten Überständen. Um selbst hergestellte C 18-Spitzen zur Entsalzung der Proben vorzubereiten, schneiden Sie zwei Scheiben aus Emcor-C 18-Material mit einer Spritzennadel aus und setzen Sie sie in eine 200 Mikroliter-Pipettenspitze ein. Stanzen Sie anschließend Löcher in die Deckel von vier 2 Milliliter fassenden Einer-Röhrchen und setzen Sie die Spitzen ein. Bedingen Sie die C 18-Stage-Spitzen mit 50 Mikrolitern Lösung B, zentrifugieren Sie drei Minuten bei 800 × g und 25 Grad Celsius.

Als Nächstes equilibrieren Sie die C 18 Stage-Tips mit 100 Mikrolitern Lösung, zentrifugieren Sie drei Minuten bei 800 ×g und 25 °C. Wiederholen Sie diesen Equilibrierungsschritt ein weiteres Mal. Führen Sie danach das Beladen der C 18 Stage-Tips mit 100 Mikrolitern der Probenüberstände aus den Triptych-Verdauungen durch und zentrifugieren Sie drei Minuten bei 800 ×g und 25 °C.

Wiederholen Sie das Beladen der Säule, um die vollständige Aufgabe der Probenüberstände sicherzustellen. Nach dem Waschen der C 18-Stage-Tips eluieren Sie die tryptischen Peptide in ein frisches 1,5-Milliliter-Einor-Gefäß mit 50 Mikrolitern Lösung B, zentrifugieren für drei Minuten bei 800 ×g und 25 °C. Wiederholen Sie den Elutionsschritt einmal und trocknen Sie die Peptide anschließend vollständig in einem Speed-VAC-Gerät ein.

Suspendieren Sie die getrockneten Peptide in 20 Mikroliter Lösung A und inkubieren Sie mindestens eine Stunde auf Eis, unterbrochen durch zwei 15-minütige Inkubationen in einem Ultraschallbad, anschließend Zentrifugation für 20 Minuten bei 16.100 × g und vier Grad Celsius, und geben Sie Senna auf nano C-M-S-M-S HSP 70. Hitzeschockproteine sind dafür bekannt, nur in Abwesenheit von ATP mit spezifischen Ko-Chaperonen und Substraten zu interagieren; in diesen mit Stickstoff-14 markierten Zellextrakten sind hs P 70 B und CGE eins nahezu ausschließlich in der löslichen Fraktion lokalisiert, unabhängig vom ATP-Zustand. Im Gegensatz dazu ist CF eins beta sowohl in der löslichen als auch in der membranangereicherten Fraktion lokalisiert.

Da die Sonikation einen Teil von CF1β vom membranständigen ATP-Synthasekomplex ablöst, dient dieser als Ladekontrolle für beide Fraktionen. Unabhängig vom ATP-Zustand wurden ähnliche Mengen an HSP70B mit anti-HSP70B-Antikörpern aus den mit Stickstoff-14 und Stickstoff-15 markierten löslichen Extrakten präzipitiert. Im Gegensatz dazu wurden geringe Mengen an HSP70B-Protein aus Membranfraktionen präzipitiert, wobei geringfügig höhere Mengen aus ATP-depletierten Membranfraktionen im Vergleich zu ATP-reichen Fraktionen stammten, wie es der erwarteten Affinität von CGE1 zu HSP entspricht.

P 70 B ist kontextabhängig. Kein CGE wurde mit HSP 70 B aus TP-reichen löslichen oder membranären Fraktionen mitpräzipitiert. Die Mengen an CGE-Protein, die mit HSP 70 B aus TP-armen löslichen Fraktionen und TP-armen membranären Fraktionen mitpräzipitiert wurden, korrelieren quantitativ mit der Menge an präzipitiertem HSP 70 B. Die Interaktion von CGE mit HSP 70 B ausschließlich im ADP-Zustand wird ebenfalls in der Analyse mittels Massenspektrometrie beobachtet.

In diesem Experiment wurden Präzipitate aus Mischungen von mit Stickstoff-14 markierten Extrakten, die kein TP enthielten, und mit Stickstoff-15 markierten Extrakten, die ein TP enthielten, hergestellt. Während die schwer und leicht markierten Formen des HSP70B-Peptids mit gleicher Intensität nachgewiesen wurden, wurde nur die leicht markierte Form des CGE1-Peptids aus den TP-depletierten Extrakten detektiert. Die gleichen Peptide aus dem Anti-HSP70D-DB-Präzipitat, das aus Mischungen von wechselseitig markierten löslichen Zellextrakten gewonnen wurde, sind hier dargestellt. Demnach wurde nur die schwer markierte Form des CGE1-Peptids in TP-depletierten Extrakten nachgewiesen, ebenso wie sowohl die leicht als auch die schwer markierten HSP70B-Peptide.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie eine gute Vorstellung davon haben, wie man ein Koimmunpräzipitationsexperiment mit Probenvorbereitung für die Massenspektrometrie-Analyse durchführt. Vergessen Sie nicht, dass Kontaminationen mit menschlichen Proteinen, insbesondere Keratin, Ihre Profilanalysen im Massenspektrometer stören können, weshalb Sicherheitsvorkehrungen wie Handschuhe, eine saubere Umgebung und LCMS-reine Bereiche während dieses Verfahrens von entscheidender Bedeutung sind.