Die Verwendung von Trace Eyeblink klassische Konditionierung hippocampale Funktionsstörung in einem Rattenmodell der Fetal Alcohol Spectrum Disorders bewerten

Das übergeordnete Ziel dieses Experiments besteht darin, zu zeigen, wie die Verwendung der Spur-Augenblinks-Klassischen Konditionierung, einer Form des assoziativen Lernens, dabei helfen kann, eine Hippocampus-Funktionsstörung in einem Rattenmodell für fetale Alkoholspektrumstörungen nachzuweisen. Neugeborene Rattenwelpen erhalten eine hohe Dosis Alkohol, eine Konzentration von 11,9 % Volumen pro Volumen Alkohol, in Form eines Binges. Dies erfolgt während des Zeitraums, der im Hinblick auf das Hirnwachstum dem dritten Trimester beim Menschen entspricht.

Dieses Muster der Alkoholexposition und -dosis ist ein entscheidender Faktor bei der Entstehung von Gehirndefiziten über die Lebensspanne hinweg, die menschlichen Fällen von FASD ähneln. Eine wichtige Hirnregion, die durch frühe Alkoholexposition beeinträchtigt wird, ist das Hippocampus. Nachdem die Ratten zu erwachsenen Tieren herangewachsen sind, wird eine Dysfunktion des Hippocampus mittels klassischer Spur-Augenblick-Bedingung untersucht.

Es handelt sich hierbei um eine hochgradige Form des assoziativen Lernens, die von der Integrität des Hippocampus abhängt. Während der postnatalen Tage vier bis neun werden die Rattenwelpen jeden Morgen gewogen und ihre Gewichte dokumentiert. Anschließend werden die Fütterungsmengen anhand einer vorausgedruckten Tabelle entsprechend dem Körpergewicht ermittelt.

Eine alkoholische Lösung mit 11,9 % Volumenteil wird Rattenwürfen über zwei Fütterungen verabreicht, die zwei Stunden auseinanderliegen. Die gesamte tägliche Alkoholdosis beträgt 5,25 Gramm pro Kilogramm Körpergewicht pro Tag. Dieses Binge-Expositions-Paradigma liefert 0278 Milliliter Alkohol pro Gramm Körpergewicht pro Fütterung in Milchlösung.

Entnehmen Sie die alkoholhaltige Milch mit einer sterilen Ein-Milliliter-Spritze. Drücken Sie anschließend überschüssige Flüssigkeit heraus, um die exakt benötigte Menge zu erhalten. Tauchen Sie die Spitze des PE-10-Schlauchs in frisches Maiskeimöl ein.

Dies erleichtert die Einführung. Messen Sie die Länge des PE-10-Schlauchs vom Mund des Welpen bis zu seinem Magen. Passen Sie gegebenenfalls den PE-50-Stöpsel an, um als visuelle Markierung für den Stoppunkt zu dienen.

Führen Sie die PE-10-Sonde vorsichtig in den Mund des Welpen ein. In der Regel tritt ein gewisser Widerstand auf, wenn die Spitze auf den Rachen trifft. Bewegen Sie die Sonde, bis sich die Spitze in den Eingang der Speiseröhre biegt.

Vermeiden Sie, dass das Röhrchen nach hinten verrutscht, da es durch das Öl rutschig sein kann. Führen Sie es weiter durch die Speiseröhre, und sobald die Spitze den gastroösophagealen Schließmuskel passiert hat, gelangt es in den Magen. Halten Sie an dieser Stelle an, stabilisieren Sie die Pumpe und geben Sie die Lösung ab.

Dies sollte langsam erfolgen. Entfernen Sie das PE-10-Schlauchmaterial vorsichtig und untersuchen Sie das Jungtier auf Rückfluss der Lösung, Blut oder physische Verletzungen. Setzen Sie das Jungtier zurück zu seinen Wurfgenossen, falls es in Ordnung ist.

Beziehen Sie sich auf das schriftliche Protokoll und die Materialliste, um die genauen Instrumente für den Augenlidchirurgie-Eingriff zu ermitteln. Desinfizieren Sie das Operationsfeld mit einem zugelassenen Desinfektionsmittel und sterilisieren Sie alle chirurgischen Instrumente und Materialien im Voraus im Autoklaven. Nachdem Sie bei der Ratte mit Isofluran eine geeignete Anästhesie eingeleitet haben, rasieren Sie den Kopf mit einem Felltrimmer und legen so viel Haut wie nötig für die Schnittstelle und das linke Augenlid frei.

Die Haut wird sterilisiert, indem drei abwechselnde Abreibungen mit 70 % Isopropylalkohol und Povidon-Iod durchgeführt werden. Befolgen Sie das Standardverfahren, um die Ratte mit den Ohrstiften am stereotaktischen Gerät zu befestigen. Setzen Sie die Operation fort, wenn die Ratte die richtige Narkoseebene erreicht hat.

Verwenden Sie die Skalpellklinge, um einen anteroposterioren Schnitt entlang der Mittellinie durchzuführen. Dieser Schnitt sollte einen Bereich freilegen, der anterior zu den Augen und leicht posterior zur Lambda-Suturallinie liegt. Benutzen Sie die Skalpellklinge, um vorsichtig das Periost von der Schädelkalotte abzukratzen, wobei übermäßige Blutungen vermieden werden sollten.

Entfernen Sie überschüssiges Bindegewebe und Blut mit einem Wattestäbchen und spülen Sie den Bereich zwischen den Abstrichen mit steriler Kochsalzlösung aus. Bohren Sie ein Loch beginnend direkt hinter der Sagittalspalte in einen Schläfenknochen. Entfernen Sie jegliches Blut und Knochenabfälle mit einem Wattestäbchen.

Verwenden Sie Splitterpinzette, um eine 0,80-Schraube zu greifen. Befestigen Sie die Schraube mit einem Uhrmacherschraubendreher in der Bohrung und ziehen Sie sie gerade so fest, dass das kortikale Hirngewebe nicht beschädigt wird, gewöhnlich drei bis vier volle Umdrehungen. Wiederholen Sie denselben Vorgang, um die restlichen Schrauben zu befestigen.

Es sollten zwei Schrauben beidseitig hinter der Sagittalsutur und eine auf dem rechten Parietalknochen, anterior zur Lambdasutur, befestigt sein. Greifen Sie die obere Haut an der Schnittstelle des linken Auges mit der vier Zoll langen Dressierzange und führen Sie die drei Zoll lange Dressierzange zur Augenecke. Nehmen Sie eine 26-Gauge-3/8-Zoll-Nadel und führen Sie sie durch die Augenlidkante.

Drehen Sie die Nadel, sodass die abgeschrägte Seite nach oben zeigt. Führen Sie die zweite Nadel in die Mitte des Augenlids ein. Greifen Sie mit einer feinen Pinzette einen 3T-Draht und führen Sie ihn in eine der Nadeln ein.

Sie müssen es nicht vollständig einführen. Wenden Sie die gleiche Vorgehensweise für den zweiten 3T-Draht an. Halten Sie beide Nadeln mit einer Hand fest, während Sie mit der anderen Hand die Kopfhalterung greifen.

Ziehen Sie die Nadeln in einer kontinuierlichen Bewegung vom Augenlid weg, während Sie die Kopfhalterung in dieselbe Richtung führen. Halten Sie die EMG-Kopfhalterung mit einer Hand fest und verwenden Sie mit der anderen Hand die dreizöllige Pinzette, um den 10T-Draht um eine oder beide Schrauben auf der rechten Seite zu wickeln. Verstauen Sie den Draht so, dass er nicht aus den Schrauben herausragt.

Der EMG-Vorstufenverstärker sollte zentriert werden, bevor mit dem nächsten Schritt fortgefahren wird. Erstellen Sie mithilfe einer vier Zoll langen Pinzette eine kleine Tasche, indem Sie die Haut, also die oberflächliche Faszie, vom Musculus temporalis lösen. Sobald die Tasche angelegt ist, schneiden Sie mit der Iris-Schere weiteres Bindegewebe weg und arbeiten Sie in Richtung der Augenecke des linken Auges vor.

Seien Sie vorsichtig, nicht zu tief einzudringen oder Blutgefäße zu verletzen. Nehmen Sie eine bipolar Elektrode und formen Sie die Drahtelektrode so, dass sie entlang der Krümmung des Musculus temporalis angebracht werden kann. Die beiden Zinken werden hinter dem linken Auge positioniert, und das untere Ende der bipolaren Elektrode wird direkt auf dem Schädel platziert.

Mischen Sie das Ortho Jet-Pulver mit flüssigen Komponenten, um eine flüssige Konsistenz zu erhalten. Tragen Sie die Paste mit einem Mikrospatel rund um die Schnittstelle auf. Achten Sie darauf, dass keine Paste in die Augen der Ratte gelangt, und halten Sie sie begrenzt.

Lassen Sie zu, dass der Ortho Jet einen halbtrockenen Zustand erreicht, und verwenden Sie dann die Splitterpinzette, um überschüssiges Acryl auf der EMG-Kopfhalterung und an den Gewinden der bipolarer Elektrode zu entfernen. Schneiden Sie überschüssigen 3T-Draht ab und lassen Sie einige Zentimeter zum Bearbeiten übrig.

Entfernen Sie vorsichtig die PTFE-Ummantelung von jedem 3T-Draht mit der feinen Pinzette, damit sie mit dem Musculus orbicularis oculi in Kontakt treten können. Bilden Sie mit der feinen Pinzette an jedem Ende der 3T-Drähte Haken aus.

Schneiden Sie den überschüssigen Draht ab, wobei darauf zu achten ist, nicht so viel abzuschneiden, dass der verbleibende Draht in das Augenlid zurückrutscht. Die Verkabelung wird im Haus hergestellt. Der weiße bipolare Stecker wird zuerst angeschlossen, wodurch der Schock-US-Reiz gegeben werden kann.

Der orangefarbene EMG-Kopfverstärkerstecker wird anschließend angeschlossen. Er erfasst die elektromyographische Aktivität, während die Ratte blinzelt. Beide Stecker führen zu einem runden Kommutator an der Oberseite des Arms, der die Signalübertragung aufrechterhält, während sich die Ratte frei bewegt.

Der Stimulusisolator wird eingeschaltet und abschließende Hardware-Prüfungen durchgeführt. Dazu gehört die Einstellung der EMG-Basislinie auf einen Pegel, der auf dem Bildschirm sichtbar ist. In Sitzung eins wird die Reizintensität zunächst auf 4 Milliampere eingestellt und anschließend alle zwei Durchgänge in Schritten von 4 Milliampere erhöht.

Dieses schrittweise Einführen ermöglicht es einer Ratte, sich an den Schockreiz zu gewöhnen. Ab dem achten Versuch wird die Schockintensität während dieser Sitzung und aller folgenden Sitzungen konstant bei 1,6 Milliampere gehalten. Ein separater Computer steuert ein Vierkanal-Digitaloszilloskop, das uns die Durchführung von Echtzeit-Signalanalysen ermöglicht.

Beachten Sie das Augenblinzeln, das von der Ratte in Box eins ausgesendet wurde. Das Oszilloskop zeigt auch, dass das Basislinien-EMG-Signal relativ sauber ist mit geringem Rauschen. Webcams ermöglichen es uns, jede Ratte ebenfalls zu überwachen.

Dies ist ein Screenshot der Software blink Version 4.0, der eine Versuchsphase zeigt, die 1400 Millisekunden dauert. In den ersten 280 Millisekunden werden keine Reize präsentiert, um eine Messung der Basislinien-EMG-Aktivität zu erhalten. Die gelbe Linie zeigt die Schwellenlinie an, bei der jede EMG-Reaktion, die 4 Volt über dem durchschnittlichen Vor-Conditioned-Stimulus-Basislinienwert liegt, als Augenblinzeln-Reaktion gilt.

Der Tondauerreiz von 85 Dezibel wird zum Zeitpunkt von 280 Millisekunden präsentiert. Der Ton bleibt 380 Millisekunden lang eingeschaltet, was dem Zeitpunkt von 660 Millisekunden entspricht. Nachdem er abgeschaltet wird, folgt ein 500 Millisekunden langer Zeitraum, in dem keine Reize präsentiert werden. Dieser wird als Spurenphase bezeichnet, in der die Ratte das Ende des Tondauerreizes mit dem noch ausstehenden Beginn des Schockunbedingten Reizes, der weiterhin zum Zeitpunkt von 1160 Millisekunden erfolgt, verknüpfen muss.

Der elektrische Reiz (US) dauert 100 Millisekunden. Natürlich löst der elektrische Reiz (US) eine defensiv bedingte Blinkreaktion aus, die als unkonditionierte Reaktion (UR) bezeichnet wird und innerhalb eines Zeitfensters von 140 Millisekunden gemessen wird. Eine Trainingssitzung besteht aus 100 Durchgängen.

Es gibt 90 Durchgänge, bei denen das CS und das US gepaart werden, und bei jedem zehnten Durchgang wird nur das CS präsentiert. Pro Sitzung gibt es 10 Durchgänge mit alleiniger CS-Präsentation. Diese Durchgänge ermöglichen es uns zu untersuchen, ob eine Assoziation zwischen CS und US gelernt wurde.

In Form von konditionierten Reaktionen, oder KR, äußert sich dies, wenn der Schock-Unbedingte Reiz (UR) nicht vorhanden ist. Die inter-trial-Intervalle werden im Durchschnitt auf 30 Sekunden festgelegt, sodass der Beginn jedes Durchgangs nicht vorhersehbar ist. In jedem gegebenen Durchgang kann die Ratte zu jedem Zeitpunkt blinzeln, und ihr EMG wird von der Software aufgezeichnet.

Jedes diskrete Augenblinzeln, das die Schwellenlinie überschreitet, wird als Reaktion in einer von vier Kategorien gewertet, abhängig davon, wann es auftritt und in welcher Versuchsphase. Wenn die Ratte während der ersten 80 Millisekunden nach dem Beginn des Tons (CS) blinzelt, gilt die Reaktion als Schreckreaktion (SR). Dabei handelt es sich um eine nicht assoziative Reaktion, die die sensorisch-motorische Leistungsfähigkeit widerspiegelt, jedoch nicht das eigentliche Lernen der CS-US-Assoziation anzeigt. Wenn die Ratte nach der SR-Phase, aber vor der Applikation des Schock-US blinzelt, hat sie eine konditionierte Reaktion gezeigt.

Wie bereits erwähnt, ist die konditionierte Reaktion (CR) das Hauptmaß für assoziatives Lernen. Es wird nicht erwartet, dass sich die CR in den frühen Phasen des Trainings entwickelt; jedoch werden diese Reaktionen im Verlauf des Trainings über viele Einheiten und Sitzungen hinweg häufiger, zeigen eine höhere Amplitude und können besser zeitlich abgestimmt sein. Wir unterteilen die CRs in zwei Typen: Gesamt-CRs und adaptive CRs.

Gesamt-CRs spiegeln die allgemeine Lernfähigkeit wider, während adaptive CRs die Fähigkeit des Tieres widerspiegeln, seinen Augenblinzler richtig zu timen. Unmittelbar vor dem Beginn des Schocks, als eine Art sich Vorbereitung, beträgt die adaptive CR-Phase 200 Millisekunden vor dem Beginn des Schock-US. Bei Säugetieren mit intaktem Hippocampus zeigt die Expression adaptiver CRs eine starke Beteiligung des Hippocampus auf höherer Ebene beim korrekten Timing des Blinzlers in Bezug auf die Applikation der beiden Reize.

Bedingt durch ihre Natur ist die klassische Spurblickfeldkonditionierung deutlich schwerer zu erwerben als die verzögerte klassische Spurblickfeldkonditionierung, bei der der Tonsignalkonditionierungsreiz (CS) und der Schockunbedingte Stimulus (US) zeitlich überlappen. Obwohl die Expression der konditionierten Reaktionen (CRs) von Versuchsteilnehmer zu Versuchsteilnehmer variieren kann und stark durch Störungen spezifischer neuronaler Schaltkreise beeinträchtigt werden kann, wird erwartet, dass die unbedingte Reaktion (UR) in jedem gepaarten CS-US-Durchlauf auftritt. Als solche spiegelt diese Messgröße die sensorisch-motorische Leistung wider und ist – ähnlich wie Schreckreaktionen – nicht per se ein Hinweis auf das Lernen der Assoziation zwischen CS und US.

In der folgenden Reihe von Videoclips sehen Sie die Software-Installation und den Beginn des Augenblinz-Trainings. Die Blink-Software wird aktiviert, und die beiden relevanten Dateien werden geladen. Eine Ratten-Datei, die Versuchspersonendaten enthält, und die Datei für die Spuren-Augenblinz-Konditionierung.

Das Programm ist bereits aktiv, bevor das Training beginnt. Sobald das Training startet, beachten Sie, dass sich rechts unten auf dem Bildschirm ein Timer befindet, der den Countdown bis zur nächsten Durchführung anzeigt. Hier ist eine Live-Videoaufnahme der Sitzung eins, Durchführung 15, bei der eine UR ausgelöst wird, aber noch keine CRs entwickelt wurden.

Hier sehen Sie eine Wiedergabe mit einem Drittel der Geschwindigkeit. In der folgenden Reihe von Ausschnitten werden Sie Bildschirmfotos derselben nicht intubierten Kontrollratte sehen, während sie sechs Trainingssitzungen durchläuft. Schließlich zeigt sie sowohl vollständige als auch adaptive KRs.

Hier ist ein Live-Videoclip der Sitzung sechs, Versuch 96, bei dem zwei Augenblinzeln auftreten, eines ein adaptives KR und das andere ein UR. Hier ist eine Wiedergabe mit einem Drittel der Geschwindigkeit. In diesem letzten Clip sehen Sie ein Live-Video einer alkoholisierten Ratte bei ihrem letzten Versuch der Sitzung sechs, einem CS-allein-Versuch. Selbst nach 600 Trainingsdurchgängen zeigt sie kein zuverlässiges adaptives KR. Nach der Datensammlung werden diese auf fehlerhafte Versuche überprüft, die aus starken Rauschartefakten und ungewöhnlicher EMG-Grundaktivität vor dem CS bestehen, wozu ein integrierter Fehleralgorithmus zur Erkennung von Ausreißern verwendet wird.

Gute Versuche, die beibehalten werden, werden weiterhin hinsichtlich konditionierter Reaktionen (CRs), unbedingter Reaktionen (URs), Gesamtkonditionierungsrate und adaptiver CRs bezüglich Prozentsatz der Reaktionen, Amplitude, Latenz und anderer entscheidender Parameter analysiert. Die mittlere adaptive CR über sechs Trainingssitzungen hinweg ist in diesem ersten Ergebnissatz dargestellt. Sowohl die prozentualen Anteile als auch die Amplitudenmaße unterschieden sich zwischen der Alkohol-intubierten Gruppe und den beiden Kontrollgruppen ab der zweiten bis zur sechsten Sitzung statistisch signifikant.

Dies zeigt an, dass die Häufigkeit und Stärke adaptiver konditionierter Reaktionen bei Ratten, die während der frühen Entwicklung Alkohol ausgesetzt waren, beeinträchtigt waren. Die mittleren unkonditionierten Reaktionen sind in diesem zweiten Ergebnissatz dargestellt. Sowohl die Häufigkeits- als auch die Amplitudenmessungen unterschieden sich zwischen den Gruppen statistisch nicht signifikant.

Diese Ergebnisse zeigen, dass eine frühe Alkoholexposition die Fähigkeit der Ratten, auf den unkonditionierten Reiz zu blinzeln, nicht beeinträchtigte, die beobachtete Beeinträchtigung jedoch auf einem Versagen bei der korrekten Assoziation von CS und US während der Erwerbsphase beruhte. In diesem Experiment untersuchten wir den Zusammenhang zwischen Gehirn und Verhalten, indem wir prüften, ob eine während der Entwicklung erfolgende Alkoholexposition in Form von Binge-Trinkverhalten Auswirkungen auf den Hippocampus hat, wie sich in Defiziten bei der Spuren-Augenblick-Klassischen Konditionierung widerspiegelt. Tatsächlich ist die klassische Augenblick-Konditionierung ein nützliches Instrument, um die neuroverhaltensbezogenen Folgen einer Alkoholexposition während der Gehirnentwicklung zu bewerten.

Es ist sehr vielseitig, da durch die Änderung der Reizparameter oder assoziativer Lernanforderungen auch die funktionelle Integrität verschiedener Gehirnsysteme außerhalb des Hippocampus beurteilt werden kann. Nach dem Ansehen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis für die Feinheiten haben, die mit der Verabreichung von Alkohol an neugeborene Rattenwelpen, der Implantation von Elektroden und der Durchführung des Augenzwinkertestverfahrens verbunden sind. Wir danken Ihnen für das Ansehen dieses Videos.