Eine einfache Fraktionierte Extraktionsmethode für die umfassende Analyse von Metaboliten, Lipiden und Proteinen aus einer einzigen Probe

Das übergeordnete Ziel dieser Methode ist es, alle wichtigen molekularen Einheiten, einschließlich polarer und semipolarer Metaboliten, Lipide und Proteine, aus einer einzigen Probe mit einer einfachen fraktionierten Methyltributylether-Extraktion zurückzugewinnen und zu analysieren. Im Allgemeinen ist es für Wissenschaftler schwierig, mehrere Verbindungsklassen aus einer einzigen Probe zu analysieren. Mit der MTBE-Extraktion, die wir hier vorstellen, können Sie mehrere Verbindungsklassen wie Lipide, Metaboliten und Proteine aus einer einzigen Probe extrahieren und analysieren.

Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie alle molekularen Verbindungsklassen robust aus einer kleinen Menge an Aliquoten in einer einzigen Probe extrahieren kann. Diese Methode hilft bei der Beantwortung grundlegender Fragen der Systembiologie, da sie die experimentelle Grundlage für die Multiomics-Analyse liefert und Fraktionen liefert, die für die Analyse durch Proteomik, Lipidomik und Metabolomik verwendet werden können. Das folgende Protokoll wird anhand von Arabidopsis-Blattgewebe demonstriert.

Arabidopsis sind kleine Blütenpflanzen aus der Familie der Brassicaceae und mit dem Kohl verwandt. Beginnen Sie diesen Vorgang, indem Sie die Halter des Gewebehomogenisator-Röhrchens mindestens 10 Minuten lang in flüssigem Stickstoff vorkühlen. Entfernen Sie die Proben aus flüssigem Stickstoff und legen Sie sie in die Röhrchenhalter.

Entfernen Sie dann die Röhrenhalter von flüssigem Stickstoff. Setzen Sie die Röhrchenhalter schnell in den Gewebehomogenisator ein und stellen Sie den Homogenisator so ein, dass das biologische Material zu einem feinen und homogenen Pulver gemahlen wird. Verwenden Sie für Blätter eine Minute lang 20 Hertz.

Die Homogenisierungszeit und -geschwindigkeit kann je nach Gewebe variiert werden. Achten Sie darauf, dass Sie homogenisieren, bis die resultierende Probe ein sehr feines Pulver ist. Und die Probe sollte bei jedem Schritt der Homogenisierung eingefroren werden.

Homogenisieren Sie die Proben und entnehmen Sie dann die biologischen Proben aus den Röhrchenhaltern. Und wenn sie nicht sofort verwendet werden, legen Sie sie bis zur weiteren Extraktion in einen Gefrierschrank bei minus 80 Grad Celsius. Beschriften Sie vier Zwei-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen mit rundem Boden und sicherem Verschluss mit der Probennummer.

Kühle die Röhren und einige Spachtel vor, indem du sie in flüssigen Stickstoff tauchst. Sobald die Röhrchen und Spatel abgekühlt sind, stellen Sie eines der Röhrchen auf eine Analysenwaage und aliquotieren Sie mit einem Spatel 25 Milligramm Gewebepulver in das Mikrozentrifugenröhrchen. Notieren Sie das genaue Gewicht für jede Probe und legen Sie die aliquoten Proben sofort in flüssigen Stickstoff.

Führe diesen Schritt schnell durch, um ein Auftauen des Pflanzenmaterials zu vermeiden. Die aliquotierten Proben werden bis zur weiteren Extraktion bei minus 80 Grad Celsius gelagert. Zur Vorbereitung der Extraktion wird das wie im Begleitdokument beschriebene Methyl-tert-Butylether- oder MTBE-Methanol-Extraktionsgemisch in einem Gefrierschrank bei minus 20 Grad Celsius vorgekühlt.

Die aliquotierten Proben werden entnommen und ein Milliliter der vorgekühlten Extraktionsmischung in jedes Probenröhrchen gegeben. Führen Sie diesen Schritt schnell aus. MTBE hat eine niedrige Viskosität und kann aus der Pipettenspitze heraustropfen.

Mischen Sie jede Probe sofort auf einem Vortex-Mischer, bis das Gewebe in der Extraktionsmischung gut homogenisiert ist. Bewahren Sie die Röhrchen in einem Gestell auf dem Tisch auf, bis alle Proben entnommen wurden. Dieser Schritt ist entscheidend.

Hier fällen wir Proteine aus und inaktivieren ihre enzymatischen Aktivitäten. Inkubieren Sie alle Proben auf einem Orbitalschüttler bei 100 U/min für 45 Minuten bei vier Grad Celsius. Anschließend beschallen Sie die Proben 15 Minuten lang in einem eiskalten Beschallungsbad.

Als nächstes geben Sie zur Fraktionierung durch Phasentrennung 650 Mikroliter einer Drei-zu-Eins-Lösung aus Wasser und Methanol in jedes Probenröhrchen. Dann eine Minute lang durch Vortexen mischen. Zentrifugieren Sie die Proben bei einer Geschwindigkeit von 20.000 g für fünf Minuten bei vier Grad Celsius.

Behandeln Sie die Rohre nach diesem Schritt vorsichtig, um eine Vermischung der beiden flüssigen Phasen zu vermeiden und das ausgefällte Granulat nicht zu stören. In diesem Stadium befinden sich zwei zulässige flüssige Phasen mit einem festen Pellet im Boden des Rohrs. Die unpolare obere Phase enthält Lipide.

Die untere wässrige Phase enthält polare und halbpolare Metaboliten. Das Pellet enthält Proteine, Stärke und die Zellwand. 500 Mikroliter des Lösungsmittels aus der oberen lipidhaltigen Phase in ein markiertes 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen überführen.

Entfernen Sie dann mit einer 200-Mikroliter-Pipette vorsichtig die verbleibende Lipidphase und entsorgen Sie sie. Übertragen Sie anschließend 400 Mikroliter des Lösungsmittels aus der unteren Phase in ein markiertes 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen. Ein zusätzliches Aliquot von 200 Mikrolitern wird in ein Mikrofurchenröhrchen übertragen, um weitere Analysen, wie z. B. eine gaschromatographische Metabolitenanalyse, durchzuführen.

Entfernen Sie den Rest der wässrigen Phase und entsorgen Sie ihn, indem Sie das überschüssige Volumen abpipettieren. Um das erhaltene Protein-Stärke-Zellwand-Pellet zu waschen, fügen Sie dann 500 Mikroliter Methanol hinzu und wirbeln Sie es dann eine Minute lang ein. Zentrifugieren Sie die Proben bei einer Geschwindigkeit von 10.000 g für fünf Minuten bei vier Grad Celsius.

Verdampfen Sie das Lösungsmittel aus den Lipidproben mit einem Stickstoffdurchflussverdampfer, um oxidative Modifikationen der Lipide zu vermeiden. Die dabei entstehenden getrockneten Proben sollten sofort analysiert werden. Das Lösungsmittel aus den wässrigen Proben wird über Nacht in einem Vakuumkonzentrator ohne Erhitzen verdampft.

Die getrockneten wässrigen Proben können vor der Analyse mehrere Wochen bei minus 80 Grad Celsius gelagert werden. Die getrockneten Lipidfraktionen werden in 400 Mikrolitern einer Lösung von sieben bis drei Acetonitril zu 2-Propanol erneut suspendiert. Füllen Sie ausreichend Flüssigkeit in die Glasfläschchen um und verschließen Sie sie fest.

Geben Sie dann die Glasfläschchen in einen gekühlten Autosampler bei vier Grad Celsius. Injizieren Sie zwei Mikroliter pro Probe und trennen Sie die Lipide auf einer Umkehrphase-C8-Säule, die bei 60 Grad Celsius gehalten wird, unter Verwendung eines UPLC-Systems, das mit einer Durchflussrate von 400 Mikrolitern pro Minute läuft. Für die chromatographische Trennung sind die in Tabelle 1 des Begleitdokuments beschriebenen mobilen Phasen zu verwenden.

Erfassen Sie die Massenspektren im positiven und negativen Ionisationsmodus mit einem geeigneten MS-Instrument, das den Massenbereich zwischen 150 und 1500 Ladungs-zu-Masse-Verhältnis abdeckt. Die polare Phase wird in 200 Mikrolitern einer Eins-zu-Eins-Lösung von UPLC-Methanol in Wasser wieder suspendiert. Füllen Sie ausreichend Flüssigkeit in die Glasfläschchen um und verschließen Sie sie fest.

Geben Sie dann die Glasfläschchen in einen gekühlten Autosampler bei vier Grad Celsius. Injizieren Sie zwei Mikroliter aus jeder Probe und trennen Sie die Metaboliten auf einer RP C-18-Säule, die bei 40 Grad Celsius gehalten wird, unter Verwendung eines UPLC-Systems, das mit einer Durchflussrate von 400 Mikrolitern pro Minute läuft. Für die chromatographische Trennung sind die beweglichen Phasen mit den in Tabelle 2 des Begleitdokuments angegebenen Parametern zu verwenden.

Erfassen Sie Vollscan-Massenspektren im positiven und negativen Ionisationsmodus mit einem geeigneten Massenspektrometer, das einen Massenbereich zwischen 50 und 1500 Masse-Ladungs-Verhältnis abdeckt. Führen Sie schließlich die Proteinextraktion, den Verdau und die Analyse durch, wie im Begleitdokument beschrieben. 25 Milligramm Arabidopsis-Blattgewebe wurden geerntet, gemahlen und extrahiert, bevor es drei analytischen UPLC-MS-Plattformen unterzogen wurde.

Die polaren und semipolaren primären und sekundären Metaboliten aus der polaren Phase wurden mittels Umkehrphasen-C-18-UPLC-MS analysiert. Basenpeak-Chromatogramme von Lipiden, die im oberen Bild gezeigt sind, und semipolare Metaboliten, die im unteren Bild gezeigt sind, wurden im positiven Ionisationsmodus analysiert. Das Tortendiagramm in der oberen rechten Ecke jedes Chromatogramms zeigt die Anzahl der identifizierten Lipide und Metaboliten, die verschiedenen chemischen Klassen zugeordnet sind.

So wurden beispielsweise 58 verschiedene Lipide der Triacylglyceridgruppe zugeordnet, die in der oberen Grafik als TAG dargestellt ist. Hydrophilere Metaboliten aus dieser Fraktion, wie z. B. Zucker und polare Aminosäuren, die keine gute Retention auf dem Umkehrphasenmaterial aufweisen, können mit anderen Analysemethoden, wie z. B. GCMS oder hydrophiler Interaktionsflüssigkeitschromatographie, analysiert werden. Die Proteine, die aus der Extraktion gewonnen wurden, wurden in Lösung verdaut und mit Hilfe von Shotgun LCMS analysiert.

Das Tortendiagramm in der oberen rechten Ecke zeigt die Anzahl der identifizierten Proteine, die verschiedenen biologischen Prozessen zugeordnet sind. So wurden beispielsweise 268 Proteine der Lokalisierungskategorie zugeordnet. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass mehr als 200 Lipidspezies, 50 annotierte semipolare Metaboliten und mehrere tausend Proteine routinemäßig aus Proben wie der in diesem Beispiel verwendeten identifiziert werden können.

Darüber hinaus zeigte die Methode eine breite Anwendbarkeit unter Verwendung verschiedener Gewebe, Organe und Zellkulturmaterialien. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie die wichtigsten Verbindungen aus einer einzigen Probe extrahieren und analysieren können. Bei diesem Verfahren ist es wichtig, alle Proben eingefroren zu halten, das Material ordnungsgemäß zu zerkleinern und Lösungsmittel und Chemikalien in analytischer Qualität zu verwenden.

Nach diesem Verfahren können alle analytischen Methoden eingesetzt werden, um die molekulare Zusammensetzung der extrahierten Proben zu bestimmen.