Eine quantitative Bewertung der Hefe Lipidome mit Elektrospray-Ionisation-Massenspektrometrie

Dieses Protokoll ermöglicht eine schnelle Analyse der Hauptbestandteile der Hefelipide. Es beginnt mit der Gewinnung und dem Waschen von Hefezellen. Gewaschene Zellen werden in eine ein- bis zweifache Chloroform-Methanol-Mischung gegeben und mit Glasperlen lysiert.

Die Zugabe von Chloroform und Wasser führt zur Trennung der beiden Phasen. Die organische Phase wird gesammelt, getrocknet, und der Lipidfilm anschließend in Chloroform zur Lagerung vor der Massenspektrometrie gelöst. Die extrahierten Lipide werden in Chloroform und Methanol mit Ammoniumhydroxid verdünnt, und eine Mischung interner Standards wird hinzugefügt.

Die Lipidlösung kann nun direkt in das Massenspektrometer injiziert werden. Hallo, ich bin Simon Bork aus dem Labor von Vladimir Teco am Department für Biologie der Concordia University. Heute werde ich Ihnen eine Methode zur Quantifizierung von Hefelipiden mittels Massenspektrometrie zeigen.

Wir verwenden dieses Verfahren in unserem Labor, um Veränderungen der Hefe-Lipide unter verschiedenen Wachstumsbedingungen zu untersuchen. Beginnen wir also. Um dieses Verfahren zu starten, resuspendieren Sie die zuvor hergestellten gefrorenen Hefe-Pellets in 1,6 Milliliter eiskaltem destilliertem Wasser und übertragen 1,6 Milliliter der Zellsuspension in Glaszentrifugenröhrchen für Hochgeschwindigkeitszentrifugen.

Beachten Sie, dass alle Manipulationen mit extrahierten Lipiden während dieses gesamten Verfahrens unter Verwendung von Glaspipetten oder -spritzen durchgeführt werden. Da Kunststoffe ein starkes Hintergrundsignal erzeugen, wenn sie mit Chloroform in Kontakt kommen, beginnen Sie die Lipidextraktion, indem Sie sechs Milliliter einer Chloroform-Methanol-Mischung im Verhältnis 1:2 und 0,8 Milliliter Glasperlen, die in einem Eppendorf-Röhrchen abgemessen wurden, der Zellsuspension hinzufügen. Die genauen Volumina sind nicht kritisch, solange das Verhältnis von 1:2:0,8 für Chloroform, Methanol und in Wasser suspendierte Hefe eingehalten wird. Vortexen Sie die Probe.

Die Zellsuspension und die Glasperlen werden zwei Mal je eine Minute gemischt, anschließend werden zwei Milliliter Chloroform zugegeben und vorsichtig vermischt; danach wird fünf Minuten bei Raumtemperatur unter gelegentlichem Mischen inkubiert. Nach der fünfminütigen Inkubation werden zwei Milliliter destilliertes Wasser zugegeben und vorsichtig vermischt. Danach erfolgt erneut eine fünfminütige Inkubation bei Raumtemperatur mit gelegentlichem Mischen.

Auch hier ist es wichtiger, das Verhältnis von zwei zu zwei zu 1,8 für Chloroform, Methanol und Wasser beizubehalten, anstatt ein bestimmtes Volumen zu verwenden. Wenn die zweite Inkubation abgeschlossen ist, zentrifugieren Sie fünf Minuten bei 3000 G bei Raumtemperatur, sammeln Sie den gesamten Überstand aus dieser ersten Extraktion in einem neuen Hochgeschwindigkeits-Glasküvette und geben Sie 3,2 Milliliter Chloroform zu den verbleibenden Zellpellets für eine zweite Lipidextraktion hinzu.

Vortexen Sie die Zellpellets mit dem zugegebenen Chloroform zwei Mal je eine Minute. Zentrifugieren Sie anschließend fünf Minuten bei 3000 Gs bei Raumtemperatur und geben Sie das Überstandsvolumen dieser zweiten Extraktion zum Überstand, der nach der ersten Extraktion gesammelt wurde. Zentrifugieren Sie danach die gesammelten Überstände fünf Minuten lang.

Bei 3000 G bei Raumtemperatur befinden sich die extrahierten Lipide nun in der unteren organischen Phase. Entsorgen Sie die obere wässrige Phase und überführen Sie die untere Phase in ein neues Hochgeschwindigkeits-Glasküvettenröhrchen. Um sauberere Spektren im Massenspektrometer zu erhalten, zentrifugieren Sie die organische Phase fünf Minuten bei 3000 G bei Raumtemperatur und überführen Sie den gesamten Überstand in ein Glasvial.

Trocknen Sie die gelösten Lipide unter Stickstoff, lösen Sie den getrockneten Lipidfilm in 500 Mikrolitern Chloroform und lagern Sie bei minus 20 Grad Celsius, bis die Proben zur Analyse mittels Massenspektrometrie bereitstehen. Bereiten Sie zunächst eine Standardmischung der in Tabelle eins des beigefügten schriftlichen Protokolls aufgeführten Lipide in Chloroform vor. Jedes Lipid repräsentiert eine andere Klasse.

Diese Lösung kann vor der Injektion der extrahierten Lipide in das Massenspektrometer bei minus 20 Grad Celsius zur späteren Verwendung aufbewahrt werden. Kombinieren Sie 10 Mikroliter der Probe mit 10 Mikrolitern der Standardmischung aus Lipiden. Beachten Sie, dass das Verhältnis von Standard zu Probe je nach Bedarf angepasst werden kann.

Trennen Sie die Probe und die Standard-Lipidmischung mittels eines Mikromassenspektrometers vom Typ Q-to-F, das mit einer Nano-Elektrospray-Ionisationsquelle ausgestattet ist, die mit einer Flussrate von einem Mikroliter pro Minute arbeitet. Die Einstellungen sind in Tabelle zwei des beigefügten schriftlichen Protokolls beschrieben. Obwohl die Verwendung der hohen Auflösung eines Q-to-F-Massenspektrometers vorteilhaft ist, ist dies keine zwingende Voraussetzung.

Die genauen Geräteparameter variieren je nach Massenspektrometer. Nach der Datenaufnahme werden die Massenspektren geglättet, der Hintergrund subtrahiert und die Peaks zentriert. Abschließend exportieren Sie die Peakliste nach Excel.

Danach normalisieren Sie die Peaks jedes Lipidglases auf ihren internen Standard. Je nach Anwendung kann es erforderlich sein, weitere Nachbearbeitungsschritte wie Deisotopierung und Dekonvolution durchzuführen. Diese Methode ermöglicht die schnelle, detaillierte Bestimmung der Hauptkomponenten des Hefe-Lipid-DO.

Hier haben wir ein Lipid hervorgehoben, das deisotopiert und auf seinen internen Standard normalisiert wurde. Wir haben Ihnen soeben gezeigt, wie man Hefe-Lipide isoliert und wie man die Hefe-Lipide mittels Elektrospray-Ionisations-Massenspektrometrie bestimmt. Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, die Verwendung von Kunststoffen zu vermeiden und die Probe im linearen Konzentrationsbereich zu halten.

Diese Methode ist sehr flexibel und viele der Volumina können bei Bedarf angepasst werden. Dieses Extraktionsprotokoll eignet sich ebenfalls für andere Methoden der Lipidanalyse, wie beispielsweise die Dünnschichtchromatographie und die mehrdimensionale Massenspektroskopie. Das war's also.

Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren Experimenten.