Visualisierung von Makrophagen extrazelluläre fallen mit der konfokalen Mikroskopie

Das übergeordnete Ziel dieser Methode ist es, zu zeigen, wie extrazelluläre Fallen von Makrophagen mit Hilfe der konfokalen Mikroskopie sichtbar gemacht und untersucht werden können. Diese Methode kann helfen, wichtige Fragen im Bereich der Entzündung zu beantworten, wie z. B. Reaktionen auf Infektionen und andere Immunreize. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass es sich um eine Modifikation einer etablierten Methode handelt, die zur Untersuchung extrazellulärer Fallen von Neutrophilen verwendet wurde.

Dieses Verfahren wird von Roleen Sharma demonstriert. Nach der Gewinnung von Lungenmakrophagen von Menschen und Mäusen durch bronchoalveoläre Lavage (BAL) gemäß dem Textprotokoll verwenden Sie Trypanblau und ein Hämozytometer, um eine lebensfähige Zellzählung an der BAL-Lösung durchzuführen. Pipettieren Sie ein- bis viermal 10 bis fünf Makrophagen in 500 Mikrolitern Kulturmedium auf Deckgläser in den Vertiefungen von 24-Well-Platten und inkubieren Sie die Zellen dann über Nacht bei 37 Grad Celsius, damit die Zellen haften können.

Entfernen Sie das Kulturmedium und verwenden Sie PBS, um die Zellen einmal zu waschen. Fügen Sie dann 2 % Paraformaldehyd-Periodat-Lysin oder PLP-Fixiermittel hinzu und inkubieren Sie die Proben 10 Minuten lang. Nachdem Sie die Zellen mit PBS kurz gewaschen haben, fügen Sie 0,2%TWEEN 20 in PBS hinzu und inkubieren Sie die Zellen 20 Minuten lang.

Um die Zellen zu blockieren, fügen Sie anschließend 10 % Hühnerserum in 5 % BSA hinzu, verdünnt in PBS, und inkubieren Sie die Proben 30 Minuten lang bei Raumtemperatur. Ersetzen Sie dann die Blocklösung durch eine Konzentration von 1 bis 100 Primär- und Isotopenkontrollantikörpern und inkubieren Sie die Zellen eine Stunde lang bei Raumtemperatur. Nach der Inkubation verwenden Sie PBS, um die Zellen zu waschen, bevor Sie die entsprechenden Sekundärantikörper hinzufügen.

Anschließend inkubieren Sie die Proben 40 Minuten lang bei Raumtemperatur. Nachdem Sie die Zellen in PBS gewaschen haben, mounten Sie die Proben mit DAPI-basiertem Eindeckmedium und visualisieren Sie die Proben dann mit einem konfokalen Mikroskop. Um die FFPE-Proben mit einer Antigen-Rückgewinnungslösung vorzubehandeln, trocknen Sie die Objektträger 60 Minuten lang bei 60 Grad Celsius im Ofen.

Übertragen Sie dann die Objektträger für 30 Minuten in Xylollösung, bevor Sie die Proben fünf Minuten lang bei 70%igem Ethanol bei Raumtemperatur überführen. Nachdem Sie die Objektträger mit Leitungswasser abgespült haben, legen Sie sie in hitzebeständige Plastikfolie und unterziehen Sie sie einer höheren Antigen-Rückgewinnung, indem Sie sie 10 Minuten lang in einen Schnellkochtopf mit Tris-EDTA pH 9,0 legen. Kühlen Sie die Proben 20 Minuten lang ab und geben Sie sie in Leitungswasser.

Legen Sie sie dann für fünf Minuten auf eine Wippe. Wiederholen Sie die Leitungswasserwäsche und waschen Sie die Rutschen dann einmal in PBS auf der Wippe. Um die Proben zu blockieren, fügen Sie 10 % Hühnerserum in 5 % BSA PBS hinzu und inkubieren Sie sie 30 Minuten lang bei Raumtemperatur.

Um dann Makrophagen-extrazelluläre Fallen oder METs in Makrophagen zu definieren, fügen Sie eine Verdünnung von 1 bis 100 Primärantikörpern in 1 %BSA PBS hinzu und inkubieren Sie die Objektträger 16 Stunden lang bei vier Grad Celsius. Waschen Sie die Proben mit PBS zweimal für jeweils fünf Minuten auf einer Wippe. Geben Sie die entsprechenden fluoreszierenden Sekundärantikörper in 1%BSA PBS und inkubieren Sie die Objektträger 40 Minuten lang bei Raumtemperatur.

Verwenden Sie nach PBS-Waschungen DAPI-haltiges Eindeckmedium, um das Chromatin zu färben und die Proben einzubetten. Nehmen Sie mit einem konfokalen Laserscankopf, der an einem inversen Mikroskop befestigt ist, Fluoreszenzbilder mit 20X 0,1 NA Luft- und 40X 1,0 NA Ölobjektiven auf. Nehmen Sie Bilder mit einer Einzelebene von 512 x 512 Pixeln auf, indem Sie auf die Schaltfläche Sequenzielle Liniennivellierung klicken.

Erhalten Sie mindestens 10 Sichtfelder pro Abschnitt für die Analyse und Daten für jedes Ergebnis. Um die Schnitte in Mikrozentrifugenröhrchen zu färben, fügen Sie die entsprechenden Primärantikörper in einem Volumen von 200 Mikrolitern hinzu und inkubieren Sie die Proben 16 Stunden lang bei vier Grad Celsius. Waschen Sie die Schnitte dreimal 10 Minuten lang in PBS, bevor Sie die entsprechenden Sekundärantikörper hinzufügen und die Proben eine Stunde lang bei Raumtemperatur inkubieren.

Verwenden Sie DAPI, um die Lungenschnitte in Lösung zu färben und die Proben 20 Minuten lang zu inkubieren, bevor Sie die Schnitte auf den Objektträgern in PBS mit Deckgläsern versehen. Verwenden Sie ein inverses konfokales Mikroskop mit einem 40X 1,3 NA-Objektiv, das mit 405 Nanometern, 440 Nanometern, 473 Nanometern, 543 Nanometern und 635 Nanometern ausgestattet ist, um Bilder aufzunehmen und 3D-Z-Stapel mit einer Dicke von 0,54 Mikrometern mit optimaler Z-Schnittung aufzunehmen. Analysieren Sie abschließend die Bilder gemäß dem Textprotokoll.

Ein Beispiel für METs in einer BAL-Stichprobe ist hier dargestellt. Das erste nachweisbare Merkmal ist die Bewegung des Zellkerns zum Rand der Zelle, wie sie in diesem früheren Stadium der MET zu sehen ist, das eine annähernd kugelförmige Form hat. Darauf folgt extrazelluläres Chromatin mit anderen co-exprimierten Mediatoren wie H3Cit und granulären Proteasen, wie sie in dieser reiferen MET zu sehen sind.

Die MET der früheren Stufe befindet sich oben links und die MET der späteren Stufe befindet sich darunter in der Mitte. Die METs des Lungengewebes sind in dieser Abbildung dargestellt. Wenn die Lunge mit Flüssigkeit aufgeblasen wird, um die Lungenarchitektur zu definieren, werden die METs gegen die Alveolarwände gedrückt.

Die Morphologie der METs variiert auch, je nachdem, in welcher Ebene das Gewebe geschnitten wurde. Die Standardschnitte, die für Lungengewebeproben verwendet werden, sind vier bis fünf Mikrometer dick. Dickere Gewebeschnitte ermöglichen die Aufnahme mehrerer Bilder und die METs können dann in 3D betrachtet werden.

Ein Beispiel für ein 3D-Bild aus Lungengewebe von Mäusen, das in 25- bis 35-Mikrometer-Schnitten geschnitten wurde, wird hier vorgestellt. Sobald diese Technik gemeistert ist, kann sie in zwei Tagen Färbung plus Bildgebung durchgeführt werden, wenn sie richtig durchgeführt wird. Wenn Sie dieses Verfahren versuchen, ist es wichtig, daran zu denken, vorsichtig mit den Wäschen umzugehen.

Nach diesem Verfahren können andere Methoden wie die Zymographie durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen wie die Proteaseexpression zu beantworten. Nach ihrer Entwicklung könnte diese Technik den Weg für die Erforschung entzündlicher Makrophagenreaktionen ebnen. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man METs mit Hilfe der konfokalen Mikroskopie visualisiert.

Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit PLP gefährlich sein kann und bei der Durchführung dieses Verfahrens immer Vorsichtsmaßnahmen wie das Tragen von Handschuhen und Augenschutz getroffen werden sollten.