Eine Array-basierte Comparative genomische Hybridisierung Plattform für effiziente Erkennung der Kopie Zahl Variationen in schnellen Neutronen induziert Medicago Truncatula Mutanten

Das übergeordnete Ziel dieses Array-basierten vergleichenden genomischen Hybridisierungsprotokolls ist die schnelle Identifizierung von Variationen der Kopienzahl in durch schnellen Neutronenbeschuss induzierten Mutanten der Leguminosenpflanze Medicago truncatula. Diese Methode hilft, zentrale Fragen im Bereich der Leguminosenbiologie zu beantworten. Zum Beispiel die Erleichterung der Identifizierung von Empathogenen an niedrigen Stellen, die an der Regulierung der Knöllchenentwicklung in Leguminosen beteiligt sind.

Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie von höchstem Ruf und Sensitivität bei der Detektion von Kopienzahlvariationen wie Deletionsmutationen in den Neutronenbeschussmutanten der Hülsenfrucht Medicago truncatula ist. Dieses Verfahren werden von mir und Hongcheng Wang, Host Doctor Fellows vom Genetic Lab, demonstriert. Frieren Sie schnell ein Gramm junges Blattgewebe, das von einzelnen Pflanzen gesammelt wurde, in flüssigem Stickstoff ein.

Verwenden Sie dann einen Mörser und Stößel und mahlen Sie das gefrorene Blattgewebe zu feinem Pulver im flüssigen Stickstoff. Extrahieren Sie die genomischen DNA-Proben des Wildtyps und der Mutante aus dem feinen Pulver mit einem DNA-Isolationskit. Verwenden Sie 500-Mikroliter-Zentrifugenröhrchen, um ein Mikrogramm jeder Wildtyp- und mutierten genomischen DNA mit doppelt destilliertem Wasser auf ein Endvolumen von 20 Mikrolitern zu verdünnen.

Geben Sie dann fünf Mikroliter zufälligen Primer in die Zentrifugenröhrchen. Wirbeln Sie die Röhrchen schnell vor und legen Sie sie nach einem kurzen Schleudern für 10 Minuten in einen Thermocycler, um die DNA-Proben bei 98 Grad Celsius zu denaturieren. Nehmen Sie nach 10 Minuten die Röhrchen aus dem Thermocycler und legen Sie sie sofort für fünf Minuten auf Eiswasser.

Bereiten Sie dann zwei Markierungsmischungen vor und fügen Sie 25 Mikroliter der Markierungsmischung als eins bzw. zwei zu den Wildtyp- bzw. mutierten DNA-Röhrchen hinzu. Pipettieren Sie die DNA und die Markierungsmischung dreimal und drehen Sie dann die Röhrchen kurz. Nach dem Schleudern inkubieren Sie die Röhrchen im Thermocycler zwei Stunden lang bei 37 Grad Celsius und anschließend 20 Minuten lang bei 65 Grad Celsius, um das Exo-Klenow-Enzym zu inaktivieren.

Fügen Sie dann 430 Mikroliter One X TE Buffer hinzu und mischen Sie den Inhalt in jedem Röhrchen. Schleudern Sie anschließend kurz die Röhrchen und überführen Sie die Lösung in den Röhrchen in Reinigungssäulen mit zwei Milliliter-Sammelröhrchen. Zentrifugieren Sie die Reinigungssäulen 10 Minuten lang bei 14.000 G und verwerfen Sie den Durchfluss.

Geben Sie 480 Mikroliter One X TE Buffer in jede Säule und zentrifugieren Sie erneut 10 Minuten lang bei 14.000 mal G. Verwerfen Sie den Durchfluss. Übertragen Sie jede der Wildtyp- und Mutanten-markierten DNAs vom Boden der Säule in neue Zentrifugenröhrchen.

Nachdem Sie das Volumen jeder der markierten DNAs mit der Pipette gemessen haben, stellen Sie das endgültige Volumen mit One X TE Buffer auf 80 Mikroliter ein und messen Sie dann die Konzentration der markierten DNAs in einem Spektralphotometer. Mischen Sie anschließend äquivalente Volumina von mutierter und Wildtyp-DNA, um Sonden auf einem Microarray-Chip für eine vergleichende Hybridisierung zu hybridisieren. Bringen Sie das Endvolumen mit One X TE Buffer auf 160 Mikroliter.

Bereiten Sie als Nächstes die Hybridisierungslösung vor und pipettieren Sie sie dreimal, um drei Wirkstoffe gut mit der gemischten DNA zu mischen. Nach kurzem Schleudern inkubieren Sie die Röhrchen in einem Thermocycler bei 98 Grad Celsius für 10 Minuten und bei 37 Grad Celsius für 20 Minuten. Denken Sie daran, die Temperatur auf 67 Grad Celsius einzustellen, um den Hybridisierungsofen vier Stunden vor der Hybridisierung vorzuheizen.

Setzen Sie dann einen Dichtungsschieber auf den Boden der Hybridisierungskammer und laden Sie nach 20 Minuten Inkubation bei 37 Grad Celsius im Thermocycler 490 Mikroliter der Hybridisierungslösung darauf. Um die Hybridisierungskammer zu bilden, decken Sie den Dichtungsschieber mit dem Medicago truncatula Genome Micro-Array-Chip ab, decken Sie dann die Hybridisierungskammer ab und ziehen Sie sie mit den Klemmen fest fest. Inkubieren Sie die zusammengebaute Hybridisierungskammer im Hybridisierungsofen bei 67 Grad Celsius für 40 bis 48 Stunden.

Bereiten Sie in der Zwischenzeit zwei Dia-Spülgeschirrs mit 250 Millilitern Washing Buffer One vor, die bei Raumtemperatur gehalten werden. Stellen Sie dann eine Schiebespülung mit dem Waschpuffer Zwei her, der bei 37 Grad Celsius gehalten wird. Bereiten Sie dann einen Objektträgerwaschbehälter mit 70 Millilitern Acetonitril und einen weiteren Objektträgerwaschbehälter mit 70 Millilitern Stabilisierungs- und Ziehlösung vor.

Stellen Sie beide Dia-Spülgläser bei Raumtemperatur in einen Abzug. Nach der Inkubation die Hybridisierungskammer aus dem Hybridisierungsofen nehmen und die Kammerklemmen lösen, um den Deckel zu öffnen. Entfernen Sie dann den Micro-Array-Chip in der Dichtungsschiene und legen Sie sie mit Wash Buffer One auf die Schiebespülschüssel.

Isolieren Sie den Micro-Array-Chip von der Abdeckfolie. Übertragen Sie anschließend den Micro-Array-Chip mit Wash Buffer One auf den zweiten Objektträger-Spülteller. Rühren Sie die Lösung mit einem Rührstab auf einer magnetischen Rührplatte bei Raumtemperatur fünf Minuten lang vorsichtig um.

Legen Sie den Micro-Array-Chip mit dem vorgewärmten Waschpuffer Zwei auf den Objektträger-Waschteller und rühren Sie dann mit dem Rührstab um, um die Lösung eine Minute lang bei 37 Grad Celsius zu waschen. Entfernen Sie den Micro-Array-Chip und legen Sie ihn zum Waschen 30 Sekunden lang in das mit Acetonitril enthaltende Objektträger-Waschglas in einem Abzug. Übertragen Sie den Microarray-Chip mit der Stabilisierungs- und Trocknungslösung in das Objektträger-Waschglas und waschen Sie ihn erneut 30 Sekunden lang.

Entfernen Sie vorsichtig den Chip und trocknen Sie ihn eine Minute lang im Abzug. Scannen Sie den Microarray-Chip mit einem Scanner mit einer Auflösung von zwei Mikrometern. Eine Signalkartierungssoftware wurde als Schnittstelle verwendet, um die Verteilung von normalisierten logarithmischen Zwei-Verhältnissen von Mutanten- und Wildtyp-Signalen über acht Chromosomen zu analysieren.

Für mutmaßliche Löschungen wird der Wert des Verhältnisses von log zwei gleich oder kleiner als minus zwei Komma fünf Standardabweichung berücksichtigt. Die Segmentierungsanalyse der Software zeigt eine geschätzte 22-Kilobasen-Deletionsregion auf Chromosom vier, die in der Grafik dargestellt ist. Die Analyse der Deletionsgrenzen, die von den Micro-Array-Sonden flankiert werden, zeigt ein reduziertes mittleres normalisiertes logarithmisches Zwei-Verhältnis.

Die Grafik zeigt auch sechs weitere annotierte Gene, einschließlich des Son-Gens, das die deletierte Region umfasst. Das Son-Gen ist für die Kontrolle der Knötchen in Metecago truncatula verantwortlich. Als nächstes zeigt die PCR-Amplifikation zur Bestätigung der Deletionsgrenzen ein Ein-Punkt-Fünf-Kilobasen-Produkt, das aus der FN6191-Mutante amplifiziert wurde, jedoch nicht im Wildtyp.

Die DNA-Sequenzierung wurde durchgeführt, um die Deletionsverbindung in der FN6191-Mutante zu zeigen, die im schwarzen Pfeil dargestellt ist. Es wurde auch eine Sequenzierung durchgeführt, die die Position der Deletionsgrenzen bestätigte. Einmal gemeistert, kann diese Technik in 72 Stunden abgeschlossen werden, wenn sie richtig ausgeführt wird.

Um qualitativ hochwertige Daten zu erhalten, denken Sie daran, die Ozonkonzentration in dem Raum, in dem der Eingriff durchgeführt wird, niedrig zu halten. Im Anschluss an dieses Verfahren können weitere Messungen wie Polymerase-Kettenreaktionen aller Genomsequenzierungen durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen wie die Größe und die Variationen der Kopienzahl im Genom zu beantworten. Das Ereignis und die Validierung dieser Technik haben den Forschern den Weg geebnet, die Variation der Kopienzahl, die sie bei Mutanten induzieren, und die natürlichen Varianten bei Pflanzenarten zu untersuchen, die für eine Insertionsmutagenese nicht geeignet sind, wie z. B. Garden P. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit Acetonitril, Stabilisierungs- und Trocknungslösung extrem gefährlich sein kann.

Vorsichtsmaßnahmen, wie das Tragen von Augenschutz, das Vermeiden des direkten Kontakts mit den Mitteln und vorsichtiges Arbeiten, sind unbedingt erforderlich.